1964年Yanofsky在研究E.coli色氨酸合成酶A蛋白時推測無義密碼子的存在。他的推測/是從兩個不同的角度：一是為trp A編碼的mRNA還編碼了trpB，trpC，trpD和trpE。即一個mRNA 分子中可以作為不同多肽的模板，那么有可能在翻譯時中途在某個位點（兩個肽的連接處〕停止，然后再從下一個新的起點翻譯，這樣使各個肽可以分開，而不至于產生一條很長的肽鏈。這就意味著終止密碼子的存在。另一個角度是他發現E.coli Trp-的突變株是不能合成完整的色氨酸合成酶蛋白，但繼續對它進行誘變可以得到回復突變。回復突變中有兩種，一種是個別發生了變化，而另一種是完全回復，沒有任何氨基酸組成的變化，這表明，E.coliTrp-不可能是任何移碼突變的結果，那么這類的突變很可能攜帶有阻止合成的無義密碼子。
1962年Benzer和他的學生S.Champe對T4 r Ⅱ突變的研究時發現野生型的T4rⅡ這段有兩個順反子rⅡA和rⅡB，共同轉錄一個多順反子mRNA，但翻譯成兩個分開的蛋白A和B。當發生缺失突變時，其中有一個突變型為r l589，證明是缺失所造成，缺失的區域含rⅡA基因右邊的大部分，和rⅡB左邊的小部分。互補實驗表明rl589的產物是一條多肽，但無蛋白A的活性，但有B蛋白的活性。Benzer認為，這種缺失可能使mRNA失去了A蛋白合成“終止”和“B”蛋白合成“起始”的密碼子，因此翻譯時沿著一條mRNA閱讀下去，產生了一條長的肽鏈。
1964年Brenner及其同事獲得了T4噬菌體編碼頭部蛋白基因的琥珀突變（amber），并進行了精細作圖，并分離研究了各種突變型的多肽。突變型的肽鏈比野生型的要短，因此可以推測琥珀突變可能產生終止密碼子，使肽的合成在中途停止下來；由于突變位點越靠近基因的左端，所產生的肽鏈越短，越靠近右端越接近野生型，據此可以推測翻譯的過程是從mRNA的5’端向3’閱讀。肽鏈的合成是從N端向C端延伸。
由于頭部蛋白80%是由新合成的蛋白質組成。因此他們將各種突變型及野生型T4噬菌體侵染E.coli后10分鐘，把14C標記的氨基酸加到培養基中，過一段時間，從感染的E.coli 中抽提蛋白，頭部蛋白可以通過14C標記來加以鑒別。