最常用的血清學方法是補體結合反應。一般用加熱處理過的衣原體懸浮液作為抗原（屬特異抗原）來測定被檢血清（屬特異血清）。哺乳動物和禽類一般于感染后7d、10d出現補體結合抗體。通常采取急性和恢復期雙份血清，如抗體滴度增高4倍以上，認為系陽性。關于血清學普查判定標準，國內暫定1∶16或以上為陽性，1∶8為可疑，1∶4以下為陰性。
1. 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）
ELISA已用于痰標本的Cpn抗原檢測。優點為特異性強、操作簡便、易于自動化，并且可用于大批量標本的檢測，另外，快速試驗過程僅需1h，臨界值易判斷，由于可檢測血清中IgM和IgG，故能區分急性感染和既往感染，適合于臨床實驗室作為Cpn感染的常規檢查；缺點為敏感性差，陽性預期值較低，不適合人群的篩查。
2. 微量免疫熒光抗體檢測（MIF）
MIF技術對肺炎衣原體的診斷是特異的且敏感性高，因此被國內外學者譽為Cpn感染診斷的“金標準”。MIF抗體包括3種：IgM、IgG和IgA。初次感染（原發感染）時，IgM于發病后3周出現，IgG于發病后6～8周出現，而IgA反應較弱或不出現；再次感染（重復感染）時，IgG常在1～2周內出現，且效價可以很高，但往往沒有IgM出現或其效價很低。目前診斷標準為：
①急性感染：雙份血清抗體效價升高4倍以上或IgM=1∶16或IgG≥1∶512；
②既往感染：IgM<1∶16且1∶16≤IgG<1∶512；
③未感染過∶IgG1∶8。總之，MIF試驗是經典的國際通用的方法，對Cpn的診斷具有高度的特異性。但該方法的抗原片制作過程復雜，實驗室要求條件高。
無論采用何種檢測方法，急性期及恢復期的雙份血清標本中，肺炎支原體特異性抗體滴度呈4倍或4倍以上增高或減低時，均可確診為肺炎支原體感染，這是目前國際上公認的標準。