照高效液相色譜法（通則0512）測定。
1、供試品溶液
取本品適量，精密稱定，加pH6.5磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋制成每1mL中約含青霉素V1mg的溶液。
2、對照品溶液
取青霉素V對照品適量，精密稱定，加pH6.5磷酸鹽緩沖液溶解并定量稀釋制成每1mL中約含青霉素V1mg的溶液。
3、色譜條件
用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以有關物質項下流動相A-流動相B（60:40）為流動相，檢測波長為268nm，進樣體積20μL
pH6.5磷酸鹽緩沖液、系統適用性溶液與系統適用性要求
見有關物質項下。
4、測定法
精密量取供試品溶液與對照品溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標法以峰面積計算供試品中C16H18N2O5S的含量，每1mg的C16H18N2O5S相當于1695青霉素V單位。