關于食品中大腸桿菌檢測方法的研究

　　摘 要：隨著人們生活水平的提高，食品安全問題受到越來越多的重視，在不斷被報道的食品安全事故中，大腸桿菌是引起這些事件的主要的影響因素之一，是判斷食品污染程度的一個重要參數，因此采用快速、可靠、簡便的方法來準確檢測食品中大腸桿菌數量是否超標是至關重要的。本文綜述了大腸桿菌的傳統檢測方法以及最新的檢測方法，為食品中大腸桿菌的檢測提供參考。 
　　大腸桿菌是人和動物腸道中最著名的一種細菌，主要寄生于大腸內，約占腸道菌中的1%，是一種兩端鈍圓、能運動、無芽孢的革蘭氏陰性短桿菌。大腸桿菌能合成維生素B和K，正常棲居條件下不會致病；若進入膽囊、膀胱等處可引起炎癥。在水和食品中檢出，可認為是被糞便污染的指標。大腸菌群數常作為飲水、食物或藥物的衛生學標準。大腸桿菌是國際上公認的衛生監測指示茵，因此大腸桿菌的檢測技術顯得十分重要，相應出現了大量的大腸桿菌的各種檢測方法[1-2]。以下綜述了一些常用的大腸桿菌檢測的傳統方法以及最近出現的新的檢測方法，為以后大腸桿菌檢測技術的發展提供一些參考。 
　　 1 大腸桿菌檢測的傳統方法 
　　1.1 多管發酵法 
　　多管發酵法是一種檢測水體中大腸桿菌的傳統方法，這種方法是在44.5℃的含有熒光底物的培養基上連續培養24h，而后能產生分解熒光底物――葡萄糖醛酸酶，從而釋放出熒光產物，進而使培養基在紫外光照射下產生特征熒光。此方法可被用來對原樣品中的菌落數作統計學估計。一般涉及以下試驗：首先是發酵，在單料或雙料乳糖膽鹽發酵管內發酵；然后是分離培養試驗，利用伊紅美藍培養皿分離；接著是在乳糖發酵管中進行二次發酵，最后通過芽孢染色、革蘭氏染色、顯微鏡觀察等來完成。多管發酵法對試驗條件要求不高，成本低，但是檢測時間較長，容易受其他條件干擾，進而影響到測定結果的精確度。 
　　1.2 濾膜法 
　　該方法基本步驟是：首先于濾器內加入約10mL無菌稀釋水，接著將適量充分混勻的待檢食品的水溶液加入濾器中，進行抽濾，快濾完前加少許無菌稀釋水以沖洗濾器內壁，使水溶液內的細菌全部集中于濾膜上；用滅菌鑷子夾取濾膜邊緣部分，移放在M-FC培養基上，濾膜截留細菌面向上，濾膜與培養基完全緊貼不能有氣泡，將培養皿緊密蓋好后，置于能準確恒溫于44.5±0.5℃的恒溫培養箱中，經24±2h培養，糞大腸菌群呈藍色或藍綠色，計數此類菌落數目。對于疑難的菌落，將可疑菌落接種于EC培養液，44.5±0.5℃培養24±2h后觀察是否產氣，以確定此類可疑菌落是否為糞大腸菌群細菌。然后計算每升水樣中糞大腸菌群數的近似值，最終換算成食品中所含大腸桿菌的數目。 
　　1.3 平板計數法 
　　平板法無菌操作用無菌吸管各吸取1mL與乳糖膽鹽發酵法相同稀釋度的樣液，移入無菌培養皿中，將冷至45℃的COLI ID選擇性顯色培養基約10mL注入培養皿內，并迅速轉動培養皿，混合均勻，待凝固后，再次將冷至45℃的培養基約5mL注入培養皿內，并迅速搖開使之覆蓋平板表層，待凝固后，翻轉培養皿置37℃培養24h后觀察菌落顏色與形態，計數。每稀釋度平行做2個培養皿。該方法是將樣本做一定比例的稀釋，其中的微生物被稀釋后分散成單個細胞，然后在一定的條件下進行培養一直到生長成能用肉眼觀察的菌落，最后通過樣本數量和稀釋度來計算出單位樣本中的菌數。 
　　 2 大腸桿菌檢測的新技術 
　　2.1 氣相色譜（GC）和高效液相色譜法（HPLC） 
　　氣相色譜法主要是將大腸桿菌經過一系列衍生化的前處理后，為接下來的分析研究提供盡可能多的化學組分。大腸桿菌的污染程度可以用頂空氣相色譜法來分析，其原理是利用食品密封系統頂部的微生物代謝產物CO2對微生物進行分析。這種方法對食品質量安全檢測有重大意義。與上述傳統技術相比，此種方法具有檢測速度快、靈敏度高的優點。高效液相色譜法（HPLC）主要是根據離子配對反相層析的原理來分析核酸。HPLC主要是針對DNA片段分離。長鏈DNA所攜帶的磷酸基團比較多，因此會有更多的TEAA與之相融合，其在柱內停留的時間增加。因為乙腈具有親水性，可以通過其而將DNA分離，在具備一定的變性溫度下，可以通過圖譜顯示明顯的吸收峰。該技術具有準確度高、靈敏度高、成本低等優點，可大大提高工作效率。 
　　2.2 ATP生物發光技術 
　　ATP生物發光技術是近些年來發展較快的微生物快速檢測方法。ATP是活細胞中最普遍的能量代謝產物，為細胞提供各種生理活動所需的能量，而且其在生物體內含量維持在一定的范圍內。ATP含量檢測的一種方法是熒光光度法，生物發光是活細胞在熒光素酶催化下發出的熒光。目前使用的熒光素酶主要來源于北美的螢火蟲，相對分子質量為62000的蛋白質，它可以催化熒光素的氧化反應，這種反應的終產物不穩定，很快分解產生熒光。與傳統檢測方法相比，不同之處在于幾分鐘內便可獲得檢測結果，而且熒光光度計是便攜式的，使用非常方便，適用于現場檢測，這種技術可以用于檢測微小的污染物水平以及食品加工設備及其表面的清潔程度的檢測。 
　　2.3 PCR檢測技術 [3-5] 
　　聚合酶鏈反應技術即P C R（polymerase chain reaction），該技術是在1971年首先被Kleppe等提出，1985年才作為一種檢測方法獲得認可。PCR檢測技術是一種聚合酶鏈反應，其采用變性―退火―延伸三個步驟使DNA基因能夠在體外實現解旋解鏈，類似于一種體外增加、復制形式。理論上可在2h內將一個DNA分子擴增到106～109倍，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物的熒光條帶。 
　　目前PCR技術廣泛用于生命科學的許多學科中。在食品微生物檢測領域，PCR可用于快速檢測食品中的微生物含量。常用的主要有免疫PCR、實時熒光定量PCR、多重PCR、反轉錄PCR和實時定量PCR等。史云等建立了用于肉及肉制品中大腸桿菌的兩重PCR檢測方法，但該方法需要較長的時間的樣品純化處理，且對操作人員的專業知識的要求也較高。 　　2.4 生物傳感器檢測技術[6-7] 
　　生物傳感器主要是以生物化學傳感技術為基礎，用抗體、酶、細胞等作為識別元件，并與信號轉換器和電子測量儀聯合構成的一種分析工具。目前已經成熟的商品化的傳感器有免疫傳感器、酶傳感器、DNA雜交傳感器、微生物傳感器、分子印跡傳感器等。生物傳感器具有諸多優點，如高靈敏度、高選擇性、較好的穩定性、低成本、且能在復雜的體系中快速在線監測。現在用于信號傳導的方法有表面聲波傳導、電氣化學方法和光學傳導法。用于食品微生物檢測的主要是免疫傳感器和基因傳感器，原理是利用DNA雜交和抗原抗體反應進行檢測，再將其轉換為光信號或電信號并通過儀器放大輸出。生物傳感器的分子識別元件的載體可采用多種材料，利用較多的是光纖、熒光光度計等。殷涌光等人利用抗體免疫吸附反應，采用一次抗體――抗原一二次抗體的夾心法將膠體金復合抗體作為二次抗體大幅度增加質量，并延長膠體金復合抗體與微生物的結合過程，放大和穩定信號，從而顯著提高檢測精度。 
　　2.5 免疫磁珠技術（IMS） 
　　免疫磁珠技術是一種大腸桿菌的分離技術。其原理是以磁珠為抗體載體，磁珠和大腸桿菌結合，通過磁力來實現力學移動進而將大腸桿菌進行分離。與其他的細菌分離方法相比，免疫磁珠技術在很大程度上提高了樣本中病原性副溶血性弧菌的檢測效率。免疫磁珠技術可以快速地在不同菌種的樣本中處理不同的微生物，該方法可以大幅度地提升檢測效率。 
　　2.6 自動化儀器 
　　自動免疫測定分析儀誕生于20世紀70年代。隨著科技的發展，自動免疫測定分析儀在各領域的應用也越來越多，該儀器使用簡單，無太多操作干擾，既省時省力，又大大提高了檢測的精確度和靈敏度。這種自動酶標免疫測試系統目前在國內外是酶免疫自動化系統中應用最為廣泛的一種。但是由于與其配套的試劑昂貴，從而限制了其在基層實驗室的使用。 
　　2.7 基因芯片技術 
　　基因芯片技術（gene chip）是20世紀90年代興起的生物技術，也叫DNA微陣列（DNA mi―croarray）。采用原位合成（in situ synthesis）或顯微打印方法，將數以萬計的DNA探針固化在支持物表面，產生二維DNA探針陣列，接著與標記的樣品進行雜交，通過檢測雜交信號來實現對生物樣品快速、并行、高效地檢測，由于它常用硅芯片作為固相支持物，而且制備中運用了計算機芯片的制備技術，所以稱為基因芯片技術。基因芯片可以對食品中的致病菌實行高通量和平行檢測，一次實驗就可以得出全部檢測結果。另外整個檢測在很短時間內即可得出檢測結果，且敏感性高，特異性強。但是也有一些問題：目前的基因芯片一般都采用熒光標記，因此需要昂貴的芯片制作系統以及激光共聚焦掃描儀，另外操作過程對工作人員要求有很高的專業素質等等。所以基因芯片的制備技術限制其應用而且還需改進。 
　　結語 
　　近年來，世界各國針對水環境和食品中大腸桿菌的快速檢測技術展開了大量研究，本文綜述了近年來常用的一些檢測方法，每種方法都有自己的優勢以及不足之處。隨著科學和生物化學技術的不斷進步，對食品中大腸桿菌的檢測精度和速度提出了更高的要求，我們只有不斷的改進以及完善相關的檢測技術，才能適應時代的要求，才能切實的解決食品安全問題，為人類的生活提供有力保障。 
　　參考文獻 
　　[1] 任強.食品大腸菌群兩種檢驗方法比較食品中大腸桿菌[J].大家健康，2013，9（7）：43. 
　　[2] 徐爾尼，許楊.快速檢測大腸菌群數的研究[J].南昌大學學報（理科版），2001，25（4）：334―349. 
　　[3] 皺碧.PCR檢測技術在常見細菌中的運用[J].健康之路，2013，12（3）：289-290. 
　　[4] 史云，李業鵬，計融.肉及肉制品中腸致病茵性大腸桿菌兩重PCR檢測方法的建立[J] 衛生研究，2005，34（3）：309-311. 
　　[5] 王升啟，陳蘇紅，張敏麗等.復合探針實時熒光PCR檢測大腸桿茵0157：H7[J].解放軍預防醫學雜志，2005，23 （6）：403―405. 
　　[6] 葛晶，殷涌光，王凱.使用SPR.生物傳感器快速檢測大腸桿菌Eeoli0157：H7[J].吉林大學學報（工學版），2005，35（2）：214―218. 
　　[7] 殷涌光，葛晶，于慶宇等.利用膠體金復合抗體提高SPR生物傳感器的微生物檢測精度[J].吉林大學學報 （工學版），2005，35（4）：446―450. 
　　[8] 潘新南.GUD熒光法快速檢驗大腸桿菌初試[J].海峽預防醫學雜志，1999，5（4）：35.