最近小編在應用CRISPR/CAS9作為工具制備基因編輯細胞株，有一些階段性總結和設想，在這里貼出來，大家可以互相探討一下。
首先要描述一下“基因編輯細胞株”的具體要求：
（1）“基因編輯”是指在特定位點引入期望的堿基修飾。
具體過程為，通過CRISPR/CAS9在待編輯位點（靶位點）附近引入基因組DNA雙鏈斷裂（DSB）后，通過同源重組介導的修復（Homology Directed Repair，HDR）引入期望的序列改變。
（2）無痕編輯。
即在得到的基因編輯細胞株中，除待編輯位點外，細胞株基因組不發生變化。
（3）純合子。
即對于得到的細胞株中，所有單個細胞對于所包含的幾套染色體（對于腫瘤細胞，多數情況為異倍體），靶位點均發生特定堿基修飾。
目前為止小編只想到3條（其實這3條就足以讓人眉頭緊蹙了），歡迎在留言區補充！
下面，小編分幾個方面羅列目前的一些總結或設想，權作拋磚引玉，繼續歡迎大家在留言區輕拍討論。
第一方面：同源模板
1）不采用ssODN（single-stranded donor oligonucleotides）。
有一原則，即要引入的突變序列越長，需要的同源臂越長。
原本ssODN對于點突變等小范圍修改是非常便利，但小編還是準備忍痛割愛。
因為效率低（得到突變純合子的平均中位值約2%），且ssODN難以引入篩選標簽，只能通過PCR的方法盲篩。對于轉染效率低的細胞，采用ssODN往往事倍功半。
2）使用Donor質粒，且需要有陽性和陰性篩選Marker
● Donor質粒結構如下：
陽性篩選Marker：加藥后，含有此基因的細胞存活。
陰性篩選Marker：加藥后，含有此基因的細胞凋亡。
● CAS9切割基因組產生DSB后，Donor質粒介導基因組的插入：
此時加入陽性篩選藥物，去除未發生HDR的細胞。
●之后轉染表達轉座酶的質粒，圖中綠色PB及中間序列被無痕切除，修飾完成：
此時加入陰性篩選藥物，去除無痕切除不成功的細胞。
在此基礎上，再通過PCR的方法篩選純合子，效率可以提高至25%左右。
3）適當延長donor質粒左右臂長度
突變片段越大，需要的左右臂長度越大，一般在600到2000之間。
4）防止CAS9二次切割
在donor質粒上，需要將對應sgRNA的PAM或鄰近PAM的序列進行同義突變，以防止donor質粒插入基因組前后被CAS9識別并切割。
5）擴增左右臂的模板選擇要慎重
左右臂需要以待突變的目的細胞基因組為模板擴增，避免不同細胞基因組差異導致左右臂不同源，降低HDR效率。
6）質粒構建難度大
構建donor質粒需要線性化質粒、左臂、插入片段、右臂4段片段連接，建議采用Gibson法。
7）質粒質量要求高
質粒純化后濃度需要高于1ug/ul。
第二方面：CRISPR/CAS9切割
1）避免脫靶
sgRNA設計避免脫靶。
采用nick形式的CAS9加雙sgRNA，實際切割效率不低，且避免脫靶。
2）sgRNA貼近編輯位點
CAS9切割位置在待修飾位點的30bp以內，最差保持在50bp以內。
3）保證sgRNA活性
sgRNA活性是影響KI的關鍵因素之一，因此需要提前驗證其活性。
4）CAS9形式選擇
縮短CAS9蛋白在細胞內的存續時間，可以避免連續切割和脫靶，建議使用mRNA或蛋白形式的CAS9。若采用質粒，需要確保其純度和濃度（建議大于1μg/μl）。
第三方面：對細胞的要求
1）細胞需保真
制備一株基因編輯細胞株所需要的時間、人力和金錢成本都是較高的，前提是細胞必須STR驗證通過。
2）提前確定靶位點序列
所有操作前，對待修飾的細胞需要提前測序了解靶位點的序列。
3）預實驗確定細胞特性
需要提前確定細胞最優轉染方式、單克隆形成能力及篩選藥物的最適濃度。
此文寫罷，才疏學淺，心下惴惴，盼在留言區見各位高論！
文獻參考
1. PMID: 27709569.CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenesis of Human Pluripotent Stem Cells in Defined Xeno-Free E8 Medium.
2. PMID: 26748756. Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells: Approaches, Pitfalls, and Solutions.
3. PMID: 27532820. Comprehensive Protocols for CRISPR/Cas9-based Gene Editing in Human Pluripotent Stem Cells.
4. PMID: 22189101Concerted nicking of donor and chromosomal acceptor DNA promotes homology-directed gene targeting in human cells.