將固定于膜上的DNA片段與探針進行雜交之前，必須先進行一個預雜交的過程。因為能結合DNA片段的膜同樣能夠結合探針DNA，在進行雜交前，必須將膜上所有能與DNA結合的位點全部封閉，這就是預雜交的目的。預雜交是將轉印后的濾膜置于一個浸泡在水浴搖床的封閉塑料袋中進行，袋中裝有預雜交液，使預雜交液不斷在膜上流動。預雜交液實際上就是不含探針的雜交液，可以自制或從公司購買，不同的雜交液配方相差較大，雜交溫度也不同。但其中主要含有鮭魚精子DNA（該DNA與哺乳動物的同源性極低，不會與DNA探針DNA雜交）、牛血清等，這些大分子可以封閉膜上所有非特異性吸附位點。具體步驟如下：
（一） 配制預雜交液：6×SSC，5×Denhardt’s試劑，0.5% SDS，50%(v/v)甲酰胺，ddH2O，100μg/ml鮭魚精DNA變性后加入。注：1.每平方硝酸纖維素膜需預雜交液0.2ml。2.預雜交液制備時可用或不用poly(A)RNA。3.當使用32P標記的cDNA作探針時，可以在預雜交液或雜交液中加入poly(A)RNA以避免探針同真核生物DNA中普遍存在的富含胸腺嘧啶的序列結合。4.按照探針、靶基因和雜交液的特性確定合適的雜交溫度（Thyb）。（如果使用標準雜交液，靶序列DNA GC含量為40%，則Thyb為42℃。）
（二）把預雜交液放在滅菌的塑料瓶中，在水浴中預熱至雜交溫度。
（三）將表面帶有目的DNA的硝酸纖維素濾膜放入一個稍寬于濾膜的塑料袋，用5-10ml 2×SSC浸濕濾膜。
（四）將鮭魚精DNA置沸水浴中10min，迅速置冰上冷卻1-2min，使DNA變性。
（五）從塑料袋中除凈2×SSC，加入預雜交液，按每平方濾膜加0.2ml。
（六）加入變性的鮭魚精DNA置終濃度200μg/ml。
（七）盡可能除凈袋中的空氣，用熱封口器封住袋口，上下顛倒數次以使其混勻，置于42℃水浴中溫育4h.