重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2 、ATP存在的連接緩沖系統中，將分別經酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。
DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。兩種DNA連接酶都有將兩個帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，而且T4噬菌體DNA連接酶還有一種大腸桿菌DNA連接酶沒有的特性，即能使兩個平末端的雙鏈DNA分子連接起來。但這種連接的效率比粘性末端的連接率低，一般可通過提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。 T4噬菌體DNA 連接酶催化DNA 連接反應分為3 步：首先，T4 DNA 連接酶與輔因子ATP形成酶-ATP復合物；然后，酶-ATP復合物再結合到具有5’磷酸基和3’羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后產生一個新的磷酸二酯鍵，把切口封起來。連接反應通常將兩個不同大小的片斷相連。
很多DNA聚合酶在進行PCR擴增時會在PCR產物雙鏈DNA每條鏈的3’端加上一個突出的堿基A。pUCm-T載體是一種已經線性化的載體，載體每條鏈的3’端帶有一個突出的T。這樣，pUCm-T載體的兩端就可以和PCR產物的兩端進行正確的AT配對，在連接酶的催化下，就可以把PCR產物連接到pUCm-T載體中，形成含有目的片斷的重組載體。
連接反應的溫度在37℃時有利于連接酶的活性。但是在這個溫度下粘末端的氫鍵結合是不穩定的。因此采取折中的溫度，即12-16℃，連接12-16h（過夜），這樣既可最大限度地發揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對結構的穩定。