關于WB實驗中蛋白樣品制備的常見問題分析

　WB實驗又稱免疫印跡實驗，是根據抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術基礎上發展起來的一種新的免疫生化技術，具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現已成為蛋白分析的一種常規技術。

　　對于一直都在做蛋白研究的你，在樣品制備中的小細節你都了解嗎？這里為大家整理了蛋白樣品制備中大大小小的常見問題，一起來學習吧！

　　1、所有WB實驗都用總蛋白就可以完成嗎？

　　當然不是，要根據WB的實驗目的來確定提取哪類蛋白，如需驗證某些低豐度蛋白，或蛋白定位，或組分間表達量對比，則需要進行亞細胞結構分離或組分分離。

　　2、如需添加蛋白酶抑制劑該如何添加？

　　內源性蛋白酶存在于胞漿中，所以要在細胞裂解前加入抑制劑到達理想的抑制效果，提取時將抑制劑添加到裂解液中，工作濃度1X。例如100X蛋白酶抑制劑，1ml裂解液中添加10ul即可。

　　3、蛋白樣品如何儲存？

　　A蛋白樣品不建議久存，也不要反復凍融。下游做WB實驗，建議蛋白濃度測定后，加入loadingbuffer煮樣，煮后根據實驗需要分裝成小管在-80℃，下次使用前拿出小管再次煮樣即可。

　　4、樣品上樣前怎么處理？

　　蛋白濃度測定后，建議將各個樣品稀釋到某一固定濃度（稀釋可以PBS，水或裂解液），加入loadingbuffer后，在沸水中煮3-5分鐘，使蛋白充分變性，也可使用PCR儀95度加熱5分鐘。

　　5、組織樣品含血量多可以直接提蛋白嗎？

　　如組織樣品中含血較多，血紅蛋白可能會影響WB實驗，可以在組織樣品裂解前使用紅細胞裂解液進行處理后，再進行蛋白提取。