逆轉錄現在已成為一項重要的分子生物學技術，廣泛用于基因的克隆和表達。從逆轉錄病毒中提取的逆轉錄酶已商品化，最常用的有AMV逆轉錄酶。利用真核Mrna3’末端存在一段聚腺苷酸尾，可以合成一段寡聚胸苷酸（oligo(dT)）用作引物，在逆轉錄酶催化下合成互補于mRNA的cRNA鏈，然后再用RNase H將mRNA消化掉，再加入大腸桿菌的DNA聚合酶I催化合成另一條DNA鏈，即完成了從mRNA到雙鏈DNA的逆轉錄過程。
所得到的雙鏈cDNA分子經S1核酸酶切平兩端后接一個有限制酶切點的接頭（linker），再經特定的限制酶消化產生粘性末端，即可與含互補末端的載體進行連接。常用的克隆載體是λ噬菌體DNA，如λgt，EMBL和Charon系列等。用這類載體可以得到包含104以上的轉化子的文庫，再經前面介紹的篩選方法篩選特定基因克隆。用這種技術獲得的DNA探針不含有內含子序列。因此尤其適用于基因表達的檢測。