1.模板DNA提取:參照參考文獻[3]方法進行。
2.PCR擴增:PCR擴增總反應體積50 μl,應用模板DNA 50 ng,在DNA擴增儀操作(Perkin Elmer Cetus),循環周期為94℃1分鐘,55℃1分鐘,72℃2分鐘,經過30個循環后,補加72℃7分鐘。
3.瓊脂糖凝膠電泳步驟:取PCR產物5 μl加1μl上樣緩沖液(0.25%溴酚藍,0.25%二甲苯氰FF,40%蔗糖水溶液)之后備用。制備2%瓊脂糖凝膠倒入水平式電泳槽中。待膠凝固后加樣,用1×TAE緩沖液作為電極緩沖液,溴化乙錠染色,電壓低于5V/cm,時間約為2小時。電泳結束后,凝膠直接在紫外透射儀上觀察結果。照像,拍片后的底片在激光掃描儀上進行掃描。
4.非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟:取PCR產物5 μg加1 μl上樣緩沖液之后備用。制備8%非變性聚丙烯酰胺凝膠,灌注于20 cm×20 cm×0. 1 cm垂直板電泳槽中, 待凝膠聚合后加樣,用1×TBE緩沖液作電極緩沖液,室溫下電泳1瓦特約14小時,待指示劑溴酚藍移到邊緣時停止電泳。將電泳后的凝膠移至方盤中進行硝酸銀染色。染色過程如下:用雙蒸餾水(dH2O)洗凝膠3次后浸泡于染色液(硝酸銀1g,加dH2O至500 ml)中30分鐘,去掉染色液,用dH2O漂洗3次凝膠,然后浸泡于顯色液(NaOH15g,38%甲醛3.8 ml,加dH2O至500ml)中約10分鐘,當顯出棕黑色DNA區帶時,用dH2O洗1次凝膠后,浸于停影液(冰醋酸25 ml,加水至500 ml)中約30分鐘,然后把凝膠移至固定液(乙醇25 ml,冰醋酸2.5 ml加dH2O至500 ml)中固定。固定后的凝膠在看片燈上觀察結果、拍照片,凝膠直接在激光掃描儀進行掃描。
3者在第2外顯子中有2個區域高度同源,3個基因分別表達各自獨立的蛋白,它們的生理作用基本一致。研究表明,在許多腫瘤細胞中有Myc基因擴增或異常表達,但在不同的腫瘤組織和癌細胞系中,Myc基因家族的成員在擴增或表達方面有些差異。因此,深入研究Myc基因3個成員與人類腫瘤的關系非常有意義。本研究建立的PCR-非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳-激光掃描技術,可同時檢測腫瘤組織中3種Myc基因的擴增情況,在腫瘤發生發展過程中,為進行3種基因各自作用機理的研究提供了簡易的實驗手段。