熱失活是終止酶切反應的一種簡便易行的方法。大多數最適反應溫度是37℃的酶在65℃下溫育20分鐘即可失活。一些在65℃下不能失活的酶如將溫度升高至80℃，溫育20分鐘也可失活。下表注明了每種酶的失活條件。
在50μl的反應體系中，37℃條件下，以0.5μg小牛胸腺DNA作為底物，加入5-10μl內切酶及相應緩沖液，反應60分鐘，然后升溫至65℃或80℃溫育20分鐘進行熱失活。在上述混合液中加入0.5μg底物DNA（通常為λDNA），調節溫度至最適反應溫度，溫育60分鐘。若瓊脂糖電泳顯示底物部分或完全被消化，則表明該酶沒有完全被熱失活。
| Enzyme | Heat Inactivation (temperature) | ||||||
| Aat II | Yes (65°C) | ||||||
| Acc I | Yes (80°C) | ||||||
| Acc65 I | Yes (65°C) | ||||||
| Aci I | Yes (65°C) | ||||||
| Acl I | No | ||||||
| Acu I | Yes (65°C) | ||||||
| Afe I | Yes (65°C) | ||||||
| Afl II | Yes (65°C) | ||||||
| Afl III | Yes (80°C) | ||||||
| Age I | Yes (65°C) | ||||||
| Ahd I | Yes (65°C) | ||||||
| Ale I | Yes (65°C) | ||||||
| Alu I | Yes (65°C) | ||||||
| Alw I | Yes (65°C) | ||||||
| AlwN I | Yes (65°C) | ||||||
| Apa I | Yes (65°C) | ||||||
| ApaL I | No | ||||||
| ApeK I | No | ||||||
| Apo I | Yes (80°C) | ||||||
| Asc I | Yes (65°C) | ||||||
| Ase I | Yes (65°C) | ||||||
| AsiS I | Yes (80°C) | ||||||
| Ava I | Yes (80°C) | ||||||
| Ava II | Yes (65°C) | ||||||
| Avr II | No | ||||||
| Bae I | Yes (65°C) | ||||||
| BamH I | No | ||||||
| Ban I | Yes (65°C) | ||||||
| Ban II | Yes (65°C) | ||||||
| Bbs I | Yes (65°C) | ||||||
| Bbv I | Yes (65°C) | ||||||
| BbvC I | Yes (80°C) | ||||||
| Bcc I | Yes (65°C) | ||||||
| BceA I | Yes (65°C) | ||||||
| Bcg I | Yes (65°C) | ||||||
| BciV I | Yes (65°C) | ||||||
| Bcl I | No | ||||||
| Bfa I | Yes (80°C) | ||||||
| BfrB I | Yes (80°C) | ||||||
| BfuA I | Yes (65°C) | ||||||
| BfuC I | Yes (80°C) | ||||||
| Bgl I | Yes (65°C) | ||||||
| Bgl II | No | ||||||
| Blp I | No | ||||||
| Bme1580 I | Yes (80°C) | ||||||
| BmgB I | Yes (65°C) | ||||||
| Bmr I | Yes (65°C) | ||||||
| Bmt I | Yes (65°C) | ||||||
| Bpm I | Yes (65°C) | ||||||
| Bpu10 I | Yes (80°C) | ||||||
| BpuE I | Yes (65°C) | ||||||
| Bsa I | Yes (65°C) | ||||||
| BsaA I | Yes (80°C) | ||||||
| BsaB I | Yes (80°C) | ||||||
| BsaH I | Yes (80°C) | ||||||
| BsaJ I | Yes (80°C) | ||||||
| BsaW I | Yes (80°C) | ||||||
| BsaX I | No | ||||||
| BseR I | Yes (65°C) | ||||||
| BseY I | Yes (65°C) | ||||||
| Bsg I | Yes (65°C) | ||||||
| BsiE I | Yes (80°C) | ||||||
| BsiHKA I | Yes (80°C) | ||||||
| BsiW I | Yes (80°C) | ||||||
| Bsl I | Yes (80°C) | ||||||
| Bsm I | Yes (80°C) | ||||||
| BsmA I | Yes (80°C) | ||||||
| BsmB I | Yes (80°C) | ||||||
| BsmF I | Yes (80°C) | ||||||
| BsoB I | No | ||||||
| Bsp1286 I | Yes (65°C) | ||||||
| BspCN I | Yes (80°C) | ||||||
| BspD I | Yes (65°C) | ||||||
| BspE I | Yes (80°C) | ||||||
| BspH I | Yes (65°C) | ||||||
| BspM I | Yes (65°C) | ||||||
| Bsr I | Yes (80°C) | ||||||
| BsrB I | Yes (80°C) | ||||||
| BsrD I | Yes (80°C) | ||||||
| BsrF I | No | ||||||
| BsrG I | Yes (80°C) | ||||||
| BssH II | Yes (80°C) | ||||||
| BssK I | Yes (80°C) | ||||||
| BssS I | Yes (80°C) | ||||||
| BstAP I | Yes (80°C) | ||||||
| BstB I | No | ||||||
| BstE II | No | ||||||
| BstF5 I | No | ||||||
| BstN I | No | ||||||
| BstU I | No | ||||||
| BstX I | Yes (65°C) | ||||||
| BstY I | Yes (80°C) | ||||||
| BstZ17 I | No | ||||||
| Bsu36 I | Yes (80°C) | ||||||
| Btg I | Yes (80°C) | ||||||
| BtgZ I | Yes (80°C) | ||||||
| Bts I | Yes (80°C) | ||||||
| Cac8 I | Yes (65°C) | ||||||
| Cla I | Yes (65°C) | ||||||
| CviA II | Yes (65°C) | ||||||
| Dde I | Yes (65°C) | ||||||
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