內含子的重要功能：幫助酵母應對壓力下的生存

　　內含子（intron）的存在，是真核細胞蛋白質編碼基因與原核細胞最大的區別。在真核細胞基因表達的過程中，需要經過RNA剪接反應將其去除。一般來說，內含子的長度遠比編碼蛋白的外顯子序列長，并且執行剪接反應的酶——剪接體高度復雜，由170多個相關蛋白組成。剪接反應需要高度精準，移碼錯位一個堿基都會導致編碼蛋白的異常【1】。內含子的存在，使得真核細胞在基因表達過程中需要耗費大量的能量和核苷酸去合成、剪除以及降解它，這無疑會增加真核細胞的生存負擔。那么內含子的存在對真核細胞有什么好處呢，它本身是否具有功能呢？

　　早先的研究發現，內含子的存在，能夠促進包含它的mRNA的表達，并且部分內含子中編碼有snoRNA和miRNA等【2, 3】，但這可能并不足以解釋耗費巨大代價而存在的內含子所具有的積極意義。1月17日，來自加拿大謝布魯克大學的Sherif Abou Elela團隊在Nature上發表了題為Introns are mediators of cell response to starvation的研究長文，該研究構建了釀酒酵母全部內含子的單獨敲除細胞，通過對所有內含子單敲細胞的表型、轉錄組以及遺傳進行整合分析，揭示出內含子自身獨立于其編碼基因的通用功能——介導細胞對饑餓的應答。另外，來自MIT的 David P. Bartel（HHMI研究員，Whitehead Institute研究員 ）團隊在Nature上以“背靠背”的形式發表了題為Excised linear introns regulate growth in yeast的研究長文，發現了酵母中34個“穩定內含子”以剪切后的全長及線性形式存在，可能與ILS剪接體結合，并發現這些穩定內含子受TORC1通路的調控，在壓力條件下調控生長速度，提高了酵母的適應性。Nature同期還配發了題為Intron RNA sequences promote cell survival的NEWS & VIEWS文章，高度評價了這兩項工作。

　　為了研究內含子自身的功能，Sherif Abou Elela團隊選取了釀酒酵母這種只有295個內含子的生物，這使得構建所有內含子單敲的生物個體具有了可行性。實際上，十多年前，Sherif Abou Elela團隊就已經開始了這項工作【4, 5】。

　　通過單敲細胞在YEPD（yeast extract peptone dextrose，酵母浸出粉胨葡萄糖）培養基中的生長表型研究，他們發現，只有5個單敲細胞（敲除295個內含子中的一個）不能生長，另外有5個單敲細胞的生長速率受到了一定影響，也就是說，只有一小部分（10/295）內含子對釀酒酵母在營養豐富的培養基中的生長是必需的。考慮到酵母在自然環境中經常遇到營養匱乏的情況，研究者又進行了單敲細胞與野生型細胞的混合競爭培養，結果發現，到培養的穩定期時，大部分單敲細胞被野生型細胞競爭淘汰了，然而補充新鮮培養基后，它們反而又取得了競爭優勢。進一步的培養研究發現，在穩定期之前的對數生長期，單敲細胞和野生型細胞的生長模式是相同的。這些結果說明，內含子對于細胞在營養匱乏的穩定期的生存是必須的，而這與內含子所在基因編碼的蛋白的功能無關。

　　通過單敲細胞在不同培養階段的轉錄組研究，研究者發現內含子對細胞生長的影響與其細胞內各種mRNA的豐度無關。但是，對野生型細胞不同培養階段的轉錄組研究發現，進入穩定期后，細胞內的內含子豐度升高了，這說明營養缺乏會導致未被剪接的mRNA的積累。然而，在單敲細胞中，穩定期仍有較高水平的RNA剪接。以上結果表明，內含子可以抑制穩定期RNA的剪接。接著，通過檢測多個內含子同時敲除的細胞，發現內含子之間具有上位效應，這說明不同內含子是通過同一條代謝通路影響細胞在穩定期的生長的。

　　接著，通過在單敲細胞中外源表達經過不同改造后的內含子基因，研究者發現，即使突變后剪接不能完成，仍然能夠使單敲細胞回復野生型的表型。但是僅表達內含子序列本身，并不能恢復單敲細胞的野生表型。進一步的基因結構定位發現，內含子所在基因的5’-UTR與內含子的功能相關，具有抑制單敲細胞在穩定期生長功能的內含子能夠與其所在基因的5’-UTR進行配對（下圖）。

　　最后，研究者對內含子在哪個代謝通路上發揮作用進行了研究。單敲細胞的轉錄組結果顯示，內含子敲除后，上調的基因主要是蛋白質翻譯和呼吸相關的基因。考慮到蛋白質翻譯相關基因中的核糖體基因受到營養敏感的TOR通路的調控，研究者具體分析了TOR通路相關蛋白與內含子單敲細胞表型之間的關系，結果發現內含子的功能處在TORC1通路下游，與TORC1共同調節核糖體基因的表達。

　　這項研究揭示了內含子自身獨立于其編碼基因的通用功能——介導細胞對環境營養物質的應答，而這可能是內含子在真核細胞的進化過程中被保留下來的一個重要原因。雖然積累的內含子能夠通過競爭有限的剪接體從而抑制細胞整體的RNA剪接【6】，但是TORC1通路如何抑制剪接體而導致內含子的積累這一重要問題在這項研究中并沒有得到解決。2017年底，美國威爾康奈爾醫學院的John Blenis團隊在Cell上發表的研究工作發現，mTORC1-S6K1-SRPK2通路能夠通過磷酸化SR蛋白從而調控RNA的可變剪接，影響脂肪生成相關基因內含子的留存【7】。在高等真核細胞中有大量的SR家族蛋白，雖然剪接體在真核細胞中高度保守，但是低等的釀酒酵母卻缺乏SR家族蛋白，目前只有一個RNA剪接相關的SR蛋白被報道【8】。所以John Blenis團隊的工作并不一定能夠用于解釋釀酒酵母在營養匱乏條件下如何通過TORC1通路導致細胞內含子的積累，這還需要進一步的研究。

　　對于另一項來自David P. Bartel團隊的工作來講，該研究同樣發現內含子具有獨立于其編碼基因的功能，即通過TORC1通路調控釀酒酵母細胞的生長。與Sherif Abou Elela團隊的發現不同，David P. Bartel團隊鑒定的介導TORC1通路的內含子是被切下來的線性內含子，不具有內含子以外的序列，并且具有此功能的內含子的個數也更少。這可能是由于兩組研究人員采用的研究方法的不同導致的，Sherif Abou Elela團隊采用的是系統的反向遺傳學手段進行全面的檢查和鑒定，而David P. Bartel團隊首先采取的是正向的研究手段，然后反向驗證，這可能導致其發現的不夠全面。雖然這兩項研究工作的結果不完全一致，但是他們都共同發現了內含子具有其自身的功能。

圖片引自Nature News & VIEWS，2019

　　高等真核生物基因中的內含子結構遠遠要比釀酒酵母復雜的多，以往的工作主要圍繞內含子影響其所在基因的功能進行探討，而這期Nature上的兩項針對內含子自身功能的研究工作，為我們進一步認識內含子的生物學功能和意義打開了一扇新的窗口。

　　周宇（武漢大學生命科學學院教授）

　　內含子在真核生物中普遍存在，是區別于原核生物的一個重要特征。在高等生物中，內含子已被報道可以在多個層面調控基因表達。內含子的主要作用是通過可變剪接產生不同外顯子組合進而翻譯出不同的蛋白，提高了蛋白質組的復雜性。內含子區域的增強子（enhancer）等調控元件可以直接調控基因的轉錄。內含子區域的RNA元件如5’ss可以抑制轉錄的提前終止。內含子剪接過程中組裝的EJC復合物可以促進mRNA的出核轉運和在細胞質的翻譯以及通過NMD途徑介導RNA降解。Splicing過程中剪切出來的內含子通常被認為是基因表達的副產物，會被快速降解。但有些內含子可以加工出多種非編碼RNA，比如miRNAs、snoRNAs、中科大單革研究組發現的EIciRNAs、以及上海生化研究所陳玲玲研究組發現的ciRNA、sno-lncRNA 和SPA lncRNA等。

　　來自Bartel和Eela實驗室的最新研究同時發現內含子的存在有助于酵母更好地應對壓力條件下的生存。Bartel等通過non-PolyA RNA-seq在處于平臺期生長的酵母中發現了34個“穩定內含子”（stable intron），這些內含子以剪切后的全長及線性形式存在，可能與ILS剪接體結合，其共有的一個顯著特征是分枝位點與3’剪接位點的距離很短（小于30nt）。進一步發現這些穩定內含子受TORC1通路的調控，在壓力條件下調控生長速度，提高了酵母的適應性。Elela等則通過系統地敲除內含子檢測突變株在饑餓條件下的存活率，發現酵母中大多數內含子可以幫助其在饑餓條件下的生存，而這種作用與內含子的宿主基因功能無關。有趣的是，這些內含子的作用依賴于5’UTR以及5’UTR與內含子形成的RNA二級結構。并進一步揭示這類內含子介導了核糖體相關蛋白（RPGs）表達的抑制，促進了營養缺失條件下酵母的存活。兩篇論文都表明這些內含子可能通過sequester剪接復合體影響含有內含子基因的表達，特別是RPGs的表達，從而調控了酵母的生長。一個區別在于Bartel發現的穩定內含子是剪切出來作為獨立的線性分子，而Elela發現內含子以RNA前體形式（依賴5’UTR），通過競爭的方式發揮ceRNA的作用影響了剪接體，兩者的具體作用機制均有待進一步闡明。

　　這兩項研究揭示了內含子新的功能范式，即內含子自身是一類具有獨立于宿主基因功能的非編碼RNA，可在營養壓力條件下直接發揮其獨特作用，這為內含子的功能研究提供了新的思路。這種模式同樣適用于其它ncRNAs的功能研究，正常條件下的loss-of-function研究可能發現不了其作用，然而在細胞壓力條件下它們可能行使重要的功能，包括病毒感染、DNA損傷、腫瘤微環境等。相較于酵母，哺乳動物具有更多且更長的內含子（人類內含子約占基因組的25%，平均1個基因約有9個內含子），其功能和作用機制將更加復雜和多樣化。有些內含子特異地滯留于細胞核內，這些內含子有何新的功能，在何種條件下發揮作用有待深入研究。內含子RNA除了影響剪接體，是否調控其它的蛋白質機器或重要RNA結合蛋白，或通過內含子自身的RNA結構及其動態來發揮作用。這些問題的研究都將促進我們進一步理解基因組中這類“暗物質”或寶藏。

　　參考文獻

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　　2. Carmel, L. & Chorev, M. The function of introns. Frontiers in Genetics 3, doi:10.3389/fgene.2012.00055 (2012).

　　3. Jo, B. S. & Choi, S. S. Introns: The Functional Benefits of Introns in Genomes. Genomics & informatics 13, 112-118, doi:10.5808/gi.2015.13.4.112 (2015).

　　4. Parenteau, J. et al. Deletion of many yeast introns reveals a minority of genes that require splicing for function. Molecular biology of the cell 19, 1932-1941, doi:10.1091/mbc.E07-12-1254 (2008).

　　5. Parenteau, J. et al. Introns within ribosomal protein genes regulate the production and function of yeast ribosomes. Cell 147, 320-331, doi:10.1016/j.cell.2011.08.044 (2011).

　　6. Munding, E. M., Shiue, L., Katzman, S., Donohue, J. P. & Ares, M., Jr. Competition between pre-mRNAs for the splicing machinery drives global regulation of splicing. Mol Cell 51, 338-348, doi:10.1016/j.molcel.2013.06.012 (2013).

　　7. Lee, G. et al. Post-transcriptional Regulation of De Novo Lipogenesis by mTORC1-S6K1-SRPK2 Signaling. Cell 171, 1545-1558.e1518, doi:10.1016/j.cell.2017.10.037 (2017).

　　8. Kress, T. L., Krogan, N. J. & Guthrie, C. A single SR-like protein, Npl3, promotes pre-mRNA splicing in budding yeast. Mol Cell 32, 727-734, doi:10.1016/j.molcel.2008.11.013 (2008).