[器材和試劑]
● PCR試劑和設備
● Wlzard PCR純化試劑盒（Promega）
● PVHlOR2引物： 5'-GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC TCG CGC GCA GTA ATA CAC GGC CGT GTC-3,
● PVH3FOR2引物：5'-GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC TCG CIGC GCA GTA ATA CAC AGC CGT GTC CTC-3'
● PVH5FOR2引物：5'-GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC TCG CGC GCA GTA ATA CAT GGC GGT GTC CGA-3'
● 膠純化VH基因文庫 （25ng/ul）
● 用于scFv基因文庫限制性消化的試劑和設備
● 用于連接scFv和pHENl DNA以及將scFv文庫電轉化到大腸桿菌的試劑和設備。
[方法]
1. 配制3個各自獨立的50ul PCR反應混合液，包含：
● 水，34.5u1
● 20×dNTPs（每種5mmol/L）， 2.5ul
● 10×Vent聚合酶緩沖液，l 0ul
● LMB3引物（10pmol/u1），2.5ul
● FORWARD引物 （10pmol/ul），2.5u1
● VH基因文庫 （25ng/u1），2.0u1
● Vent DNA聚合酶（2單位），1.0ul
2. 在有加熱蓋的熱循環儀內加熱反應物到94℃ 5分鐘。
3. 以94℃30秒、42℃30秒、72℃1分鐘的條件共循環25次，再次擴增VH基因。
4. 用Wlzard PCR純化試劑盒純化PCR產物。
5. 用NcoI和NotI消化PCR產物。
6. 將消化的PCR產物連接到NcoI/NotI消化的pHENl中，并電轉化到大腸桿菌TGl細胞中，建立3個VH基因片段噬菌體丈庫。測定文庫容量并將細菌性丈庫材料儲存于-70℃。
7. 從每種VH基因文庫中制備DNA:用含甘油丈庫儲存材料細菌接種到含l00ug/m1氨芐青霉素和1%葡萄糖的100m1
2×TY培養基中。接種量應足夠大以保證接種細菌數至少比文庫容量大5倍。過夜培養后，按標準的DNA質粒制備方法進行操作。為了續后進行文庫消化，可合并不同丈庫的DNA.