農桿菌介導轉化擬南芥

實驗概要

1. 學習真核生物的轉基因技術及農桿菌介導的轉化原理。

2. 掌握農桿菌介導轉化擬南芥 的實驗方法，了解擬南芥的生理特點及在基因工程實驗中應用

實驗原理

擬南芥（Arabidopsis thaliana）是一種十字花科植物，二年生草本，高7～40厘米，花期3～5月。廣泛用于植物遺傳學、發育生物學和分子生物學的研究，已成為一種典型的模式植物，其原因主要基于這種植物具有以下特點：

（1）形態個體小，生活力強,種子量大；

（2）生長周期快，從播種到收獲種子一般只需6--8周；

（3）基因組小(2n=10)，是目前已知植物基因組中最小的，但是具有完成“復雜”的植物生長發育的所有基因；

（4）擬南芥是自花授粉植物，易于獲得純合突變體。
 

 擬南芥的培養：

    將擬南芥種子經10%雙氧水消毒后接種于MS培養基上，于22℃、光照10h培養1-2周，長出無菌苗后轉移至坧石和土（3：1）混合物上培養。

注意： 濕度要大一些。

轉化原理
1. 農桿菌對雙子葉植物的創傷部位侵染廣泛，在某些條件下對單子葉植物也有一定的感染性。

2. 根癌農桿菌含有  Ti  (tumor-inducing plasmid)質粒，Ti  質粒上的  T-DNA（transferred DNA）在  Vir區（virulence region）基因產物的介導下可以插入到植物基因組中，誘導在宿主植物中瘤狀物的形成。因此，將外源目的基因插入到  T-DNA  中，借助  Ti  質粒的功能，使目的基因轉移進宿主植物中并進一步整合、表達。　

雙元表達載體系統
 雙元表達載體系統主要包括兩個部分：

　　一部分為輔助Ti質粒，這類Ti質粒由于缺失了T－DNA 區域，完全喪失了致瘤作用，主要是提供Vir基因功能，激活處于反式位置上的T－DNA的轉移。

　　另一部分是微型Ti質粒(Mini-Ti plasmid)，它在T－DNA左右邊界序列之間提供植株選擇標記，如Hyg基因或Lac Z基因等。　　

主要試劑

1．含有雙元載體的農桿菌GV3101懸浮液（對數生長期）：將目的基因構 建到雙元載體上，之后，將重組的雙元載體轉入農桿菌GV1301并用卡 那霉素（50mg/ml）篩選含有重組雙元載體的菌落。將農桿菌接種在LB 液體培養基（含有慶大霉素25mg/L用于篩選Ti質粒，卡那霉素50mg/L 用于篩選T-DNA）中，28℃，180r/min條件下震蕩培養至對數生長期， T-DNA 28 180r/min 在4℃和-20℃分別保存菌株備用。

2．浸染液：1/2MS，1×B5維生素，5%蔗糖，50ml/L Silwet L-77， 0.044mM benzylamino purine (10ml/L of 1 mg/ml stock in DMSO) 。 或使用只加入5%蔗糖和50-500ul/L Silwet L-77的水溶液作為浸染液。 （本實驗選用此種浸染液） （5%蔗糖200ml   10ulSilwet L-77 ）

實驗材料

農桿菌GV3101重組菌株，重組雙元表達載體pCAMBIA1300 ，擬南芥

實驗步驟

 
1．在轉化前三天，接種含有雙元載體的農桿菌到5ml含有抗 生素（慶大霉素20mg/L，卡那霉素50mg/L）的LB液體培 養基中，28℃下震蕩培養2天。

2．兩天后，將1ml培養的農桿菌轉移到100ml含有抗生素的 LB液體培養基中，28℃繼續震蕩培養24小時。 （前面步驟由實驗技術人員準備：保證每組有約80ml-100ml 的農桿菌，事先分裝到兩個50ml的離心管中。）

3．將農桿菌轉入離心管中，6000rpm/min，室溫條件下， 離心10分鐘，然后將上清倒出。 

4．將沉淀用200ml浸染液重懸，形成均勻的農桿菌懸浮液 （OD600=0.8左右），并將農桿菌懸浮液轉移到一個敞口 的器皿中（500ml燒杯）。

5．選取初果期的健壯植株，帶盆缽一起倒扣于盛有農桿菌懸 浮液的容器上方，將整個花序浸入上述農桿菌懸浮液中約 20-30秒，注意葉片盡量不與浸染液接觸。同一個燒杯中 的農桿菌懸浮液可以轉化10株或者更多株擬南芥。在此過 程中，盡量避免將蛭石倒入農桿菌懸浮液中。

6．將盆缽取下，橫放于暗箱中約24小時。注意保持一定的 濕度。

7．24小時后將處理過的擬南芥植株放于22～25℃的光照條 件下使其正常生長。

8．大約三周后收取成熟種子。

注意事項

1. 在箱底撒水保濕，然后將花盆平放到箱子中，并用塑料袋罩住箱子暗培養16-24h（過夜）后，將擬南芥放置于塑料培養池內，并澆足horgland營養液，恢復正常培養。

2. 為了提高轉化率，去除塑料袋3d后，用吸管吸取適量重懸目的質粒的新鮮轉化液，逐個醮沾花蕾。

3. 轉化后擬南芥的培養恢復正常管理，一旦再出現側蘗或主苔出現分枝，及時剪除。

4. 轉化5-6周后，為了加速擬南芥成熟可以適量少澆營養液。待擬南芥個別角果開始枯黃后，可將其角果剪下放于培養皿內干燥。擬南芥角果大部分

5. 枯黃后，即可收取全部種子存于1.5ml 的EP管中（在蓋上扎一小孔以便干燥）。種子完全干燥后，放于1.5ml 新EP管中4℃短期保存。如需要可放于-20℃冰箱內長期保存。