農桿菌介導的遺傳轉化程序

實驗概要

農桿菌侵染實驗

實驗步驟

(1) 農桿菌菌液的制備  

將農桿菌接種于附加50mg/L Km、50mg/L Sm、50mg/L Rif的YEB固體培養基上，28℃暗培養，至長出單菌落。用接菌環挑取單菌落，接種在5mL含相應抗生素的YEB液體培養基中，于28℃，200r/min 培養過夜。待菌液長至OD600為0.4 ~ 0.6時，將其按1∶10的比例接種到新鮮的上述培養基中振蕩培養，進行二次活化。當OD600為0.5 ~ 0.6 時，吸取菌液于無菌離心管中，2000 r/min離心10min，去上清，用等體積的YEB液體培養基重懸，備用。

(2) 侵染 

取繼代8天的愈傷組織，置于無菌三角瓶內，加入適量重懸好的菌液，浸泡15~20 min，此間要不時的搖動。浸泡完后，棄菌液，用無菌濾紙吸干多余的菌液。

(3) 共培養 

侵染過的愈傷組織接種于共培養培養基（含有100mg/L阿魏酸的繼代培養基）上，28℃暗培養3~5d，以肉眼可見菌落為準。

(4) 除菌 

取共培養后的愈傷組織，放于無菌三角瓶內，先用無菌水沖洗至溶液澄清為止，然后轉入液體繼代培養基 100mg/L Ac，120r/m震蕩培養過夜，其間每隔2～3小時換一次液，再沖洗2~3次后轉到附加100mg/L Ac的固體繼代培養基上。

(5) 篩選  

將除菌一周后的植物材料轉至分化篩選培養基MS 2mg/L 6-BA 30g/L Suc. 100mg/L Ac 0.7mg/L Bia中進行轉化篩選及除菌，同時誘導再生植株，兩周繼代一次。