制備轉化用的農桿菌菌液
準備:
1.滅菌 試管 400毫升細長燒杯2瓶,離心瓶4-6個(250ml)。
2.試劑:YEP 1200ml(每瓶300ml 共4瓶)+Kan 1;1000,Rif1:500。
1/2MS+2%蔗糖(滅菌115度20分鐘),Silwet在-20℃貯存。
3.步驟:
共轉化農桿菌:于中午12點接菌于有YEP培養液的試管中10ul:10ml接種。28℃,3000rpm搖過夜,約30小時,次日下午6點將已搖活的菌按(1:400)及750ul菌液轉至漢300毫升YEP+K50+Rif中培養28℃,300rpm約14小時,次日上午8點測OD值,用YEP+Rif作為空白對照,當菌液達到OD600為1.5~3.0之內時,可收集菌體于250ml離心瓶(滅菌),4℃,4000g 離心10min 。用10%蔗糖(含0.02%silwet)稀釋至OD600 約為0.8-- 1.0左右即,用10%蔗糖作對照。轉化時將花在溶液中浸泡50s左右,于弱光下生長。
4.澆水:轉化前一天將需要做轉化的野生型擬南芥苗子澆水澆透。
(注意:選取上述配好的溶液2ml,充分打碎管底部的菌體,在將混勻的菌體溶入600ml溶液中,混勻后再加入Silwet(100%)120ul終濃度為0.02%)。
2.先將澆透水用于轉化的苗子的夾全部剪掉,再用寬膠帶把花盆的土封好。
3.轉化的準備工作:2個400細長燒杯,寬膠帶,記號筆,表等。
4.轉化過程略,視苗的長勢弱 0.8 Pa 3`,長勢好的0.8 Pa 5`。
5.標記好,將轉化好的苗平放于盒子內,上蓋封口膜封好,避光培養24hrs 2天后,將植株立起正常培養,澆水,3天1次。