農桿菌的轉化

實驗概要

本實驗介紹了農桿菌感受態細胞的制備及轉化方法。

主要試劑

YEP固體培養基，含有相應抗生素的YEP培養基，0.15mM NaCl，20mM CaC1₂，液氮，選擇平板(Rif 100ug/mL加Gm 50ug/mL加Kan 50ug/mL )

主要設備

培養箱，搖床，離心機，-80℃冰箱

實驗步驟

1. 感受態細胞制備

   1) 將農桿菌在含有相應抗生素的YEP固體培養基上劃線，30℃培養2-3天，出現菌落。

   2) 挑取單菌落置于5mL含有相應抗生素的YEP培養基中，220rpm，30℃培養過夜。

   3) 取過夜培養的菌液2mL，轉接在100mL含有相應抗生素的YEP培養基中，220rpm，30℃繼續培養至O.D600=0.5。

   4) 將菌液冰浴30min，然后在4℃條件下500rpm離心5min，棄去上清。

   5) 將菌體重懸于l0mL 0.15mM NaCl中，4℃條件下500rpm離心5min，棄去上清。

   6) 將菌體重懸于1 mL 20mM CaC1₂中，分裝成0.2mL的小份在液氮中速凍之后保存于-80℃冰箱或立即使用。

2. 轉化

   1) 加質粒(0.1-0.5ug)于融化的感受態細胞中，混勻，冰上放置25 min。

   2) 液氮速凍60 s，37℃放置3 min。加100uL液體YEP培養基，28℃復蘇培養3h。涂于選擇平板(Rif 100ug/mL加Gm 50ug/mL加Kan 50ug/mL )，28℃培養2至3天。