冰凍切片免疫熒光

實驗原理

抗原抗體結合

主要試劑

固定液、梯度蔗糖、磷酸鹽緩沖液、封閉液、一抗、熒光標記的二抗、DAPI、熒光抗淬滅封片劑

主要設備

冰凍切片機、熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡

實驗材料

組織切片

實驗步驟

切片

1. 提取新鮮組織置于4%多聚甲醛中固定；

2.梯度蔗糖脫水：10%-20%-30%；

3.冰凍包埋劑包埋并切片，切片厚度4~10μm;

4.-20℃保存切片并盡快染色以防止蛋白降解；

染色

1. 冰凍切片取出復溫至室溫，或用烤片機烤干切片表面水分；

2.丙酮或多聚甲醛固定5-10min;

3.PBST洗5 minx3次;

4.（可選）抗原修復可選；

5.（可選）0.1% Triton-100X透膜；

4.加山羊血清封閉液或3%BSA封閉30min;

5.棄去封閉液，滴加相應抗體（1%BSA稀釋），保濕盒中4℃過夜；

6.PBST洗 5 minx3次;

7.滴加二抗，避光，37℃，1-2 h；

8.PBS洗 5 minx3次；

9.DAPI染色 5 min；

10.PBST洗 5 minx3次；

11.滴加抗淬滅封片劑并用蓋玻片封片；

12.熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。