冷凍電鏡三維重構

摘要：冷凍電子顯微學從創立到現在已發展成為確定蛋白質分子，蛋白質復合物和細胞器結構的一種有效、的方法這表現在三位冷凍電鏡技術的不同方面。這主要包括適合于顯微鏡真空環境的樣品制備條件，減少輻射損傷的策略，提高未經染色的電子顯微像的信躁比的方法和二位投影三位重構的不同方法。冷凍電鏡通過高壓快速液氮冷凍的制樣方法能夠使樣品處在接近于生理環境的玻璃態冰中從而保持其天然構像，并且由于快速冷凍可以捕捉到某個反應過程的中間狀態從而可以對大分子復合物進行生物學功能的動態研究。確定三維結構的方法主要有電子晶體學方法、單粒子重構法和電子斷層成像技術。在主要的測定結構的方法種，冷凍電鏡是唯一的能研究小到小的蛋白質，蛋白質復合物大到細胞器甚至整個細胞的方法。
關鍵詞：冷凍電鏡；三維重構；單粒子法；斷層成像；電子晶體學

引言

在大量的基因序列被闡明后人們發現這還遠遠不能解釋復雜的生命活動，必須對功能活動的執行者基因的表達產物蛋白質進行結構和功能上的研究才能更好的理解生命過程。而以蛋白質為主體的生物大分子的功能主要決定于它們的三維結構。因此以Ｘ射線晶體學、核磁共振技術(ＮＭＲ)、電子顯微學和計算生物學為基本研究手段的結構生物學將在其中扮演越來越重要的角色。Ｘ射線晶體學是目前分辨率最高的結構測定方法，已經非常成功地解析了大量單個分子的三維結構。但是這種方法有一定的局限性：由于大分子復合物不易于形成三維晶體，很多疏水性蛋白也不易于形成晶體，或者只有在去除一些柔性區域后才能形成好的三維晶體，這限制了Ｘ射線晶體學的應用范圍，另外由于晶格的約束干擾了對分子間相互作用，這并不利于對于蛋白質的功能進行研究。NMR非常適合對水溶性的蛋白質進行三維結構測定，雖然也發展了一些新的技術如固相核磁共振（solid-NMR）等可用于對小的膜蛋白的結構測定，但需獲得在脂雙層上高度有序排列的樣品，而且分子量仍然是NMR的一個限制因素。

二十世紀七十年代Taylor K和Glaeser RM開創了冷凍電子顯微術（cryo-electron microscopy,Cryo-ME），經過近三十年的發展，冷凍電鏡技術已經成為研究生物大分子結構與功能的強有力的手段。最近幾年冷凍電鏡的發展在研究大分子結構上的分辨率已達到10-15 。雖然不及Ｘ射線晶體學,但它具有許多獨特的優勢：可以對均一的（如膜蛋白的二維晶體，二十面體對稱的病毒等對稱結構）不均一的（如核糖體等）樣品用不同的方法進行三維結構重構，可以對生物大分子及其復合物或亞細胞結構進行測定，使小到蛋白質大到真核細胞的三維結構得以確定，分子量大小跨越了12個數量級。通過快速冷凍可以將樣品保存在生活狀態，其結構更接近功能活性狀態；由于快速冷凍可以捕捉到反應過程的瞬時狀態從而易于進行時間分辨層面上的研究，從而對一些反應瞬時過程，和反應中間體進行研究，有助于對蛋白質的動力學特性和功能的研究。

三維冷凍電鏡技術將更完善的樣品制備方法，先進的儀器設備，更好的成像方法和強有力的數據處理和運算方法結合起來，使結構測定的分辨率不斷得到提高。樣品制備主要采用快速冷凍的方法，以保持其天然活性；儀器設備則可采用場發射電鏡和CCD（charge-coupled detector,電耦合探測器）攝像系統；確定結構的方法主要有電子晶體學、單粒子法和電子斷層成像技術，對于數據處理則主要借助各種軟件和傅立葉變換的算法進行二位圖像的三維重構以獲得實物空間的三維結構。本文將在這幾個方面介紹冷凍電鏡三維重構技術及進展。