近日，蘇黎世聯邦理工學院的研究者申報了一項ZL檢驗系統，借此能夠免除成千上萬次的動物實驗。為此，須在藥物制劑的批次控制時將脂質體的納米艙與肉毒桿菌神經毒素共同投入使用。
如今，藥物制劑如肉毒桿菌Botox（瘦臉用）、Bocouture（除眉間紋用）或者Azzalure（眼表整容用）已在全球廣泛用于面部整容治療。其活性成分稱之為肉毒桿菌神經毒素(BoNT) 的制劑，除應用于美容手術之外，還逐步進入更多的應用領域，包括針對斜視、肌肉痙攣或肩周炎等治療中，還被準予用于治療特殊的控制力喪失癥。鑒于此，科研人員已將該毒素稱為21 世紀的阿司匹林。
肉毒桿菌中毒
肉毒桿菌起初的名聲并不好，20世紀初，肉毒桿菌神經毒素作為致命性食物中毒的原因而為世人知曉，即肉毒桿菌中毒。食品保存不當可能引起肉毒梭狀芽孢桿菌的污染，尤其是在缺氧條件下制造的食品（如香腸罐頭）可能產生細菌和肉毒桿菌神經毒素。食用受此污染的食品會引發嚴重的中毒癥狀，僅幾毫克的劑量便能致死。如今，該毒素成為人類已知的毒性最強的物質。肉毒桿菌神經毒素的致命毒性要比其他任何天然毒素的毒性高100倍以上，比任何人工合成的化學毒劑的高5000倍以上。因此，為避免風險，相應的藥物（如Botox) 的生產許可要受到嚴格的管控。
圖1. 肉毒桿菌中毒機理示意圖，運動神經元上的神經毒素。
用于批次控制的“鼠標”測試
為對每個制造批次毒素的毒性進行準確測定，大多數的制造商均會對含有肉毒桿菌神經毒素的藥物制劑進行小鼠半數致死量實驗法（Maus-LD50-Test)。在進行檢驗時，對實驗動物注射不同稀釋度的藥物制劑。隨后觀察動物出現中毒的臨床癥狀，并最遲于注射后96h內致死。Maus-LD50-Test的主管部門根據實驗過程中受試動物所出現的痛苦狀態，將其定位為最嚴重程度級別為3級（動物的最大痛苦程度）。
由于全球對含有BoNT 藥物制劑的需求日益增長，相應地就要進行更多的老鼠實驗。此外，該實驗還在醫學診斷中廣為推行，旨在用于驗證肉毒桿菌中毒（如美國疾控中心CDC）。由于絕大多數制造商通常不公布相關數據，因此只能對實際的動物實驗規模進行大致的估算。根據動物保護組織預計，每年用于實驗的數量達600000。
為便于比較，2011年瑞士境內落戶的所有制藥企業和研究機構（不生產含BoNT藥物制劑者）均進行了數量大致相同的動物實驗（瑞士聯邦獸醫局）。
尋找替代方法
為遵照動物實驗的3R原則，即改善、減量、取代原則，全球科研人員內正努力取代沿襲至今的動物實驗法。如在與實驗條件相適配的情況下，如何減輕受試動物的痛苦（改善refine）；改進計算和解釋方法，旨在減少所需的實驗動物的數量（減量reduce）。而最大的挑戰則是要找到一種能徹底取代Maus-LD50-Test的方法。
然而，許多知名的不用動物實驗進行檢驗的方法（取代replace)，都由于毒素的復雜生物功能而歸于失敗。毒素的作用主要體現在運動神經元上，通過釋放出一定的信使物質，神經細胞指揮附件的肌肉細胞進行收縮。通過一種復雜的機理，毒素能夠結合在運動神經元的細胞表皮上，還有一部分輕鏈會滲透到細胞內部。這些輕鏈又會在細胞內部裂解出特定蛋白質，而特定蛋白質通常能夠參與運動神經元活性物質的釋出（如圖1 所示）。若不能消除該信使物質，附近的肌肉便不再收縮，從而導致癱瘓。動物實驗或細胞培養實驗均已保留有反應的復雜順序。
本文旨在尋找一種檢測系統，使之允許在盡可能接近實際條件下進行毒素的檢測，同時又優于的細胞培養實驗方法（如費力的護理和繁雜的實驗）。為次，實驗人員應用了脂質體人工膜。
圖2. 經部分冷凍干燥過的脂質體薄膜的一種冷凍碎片的Kyro掃描電子顯微鏡攝像圖。圖中白色橫條最大長度約200nm。
根據所用膜的組成成分，科研人員能夠在一定程度上模擬某些細胞的種類。采用干脂類水化法制備相應的脂質體的膜。為此將其后在脂質體膜中所希望的脂類以及脂質受體溶解于有機溶劑中。將有機溶劑蒸發之后，就有脂類的薄層留于容積壁上，在容積壁上加相應的水溶液緩沖劑。
由于脂類只能溶于非極性液體而不溶于水溶液中，從而形成一種如牛奶般的白色乳濁液，該乳濁液系由億萬個極為不同的形狀和大小的脂質體所組成。為了獲得均勻一致的分布，再將脂質體通過一臺壓鑄機壓制成大約100nm的薄層（如圖2 所示）。由于光線通過這些微小顆粒時不易折射，因此乳濁液看上去近乎透明。
檢測脂質體
為了檢測毒素不同的反應步驟，不僅脂質體膜設置相應的脂類，還集成相應的接受蛋白質于脂質體薄膜之中，蛋白質通常能夠將毒素結合到運動神經元上。一旦毒素將受體結合到脂質體膜中，就會模擬如同發生在活體細胞中的過程，吸允周圍環境的液體，借此毒素中的輕鏈就能滲透到脂質體的內部（如圖3 所示）。由于該分裂僅發生在毒素有效結合、且在小的子單元轉入到脂質體之后才能進行，于是通過對應的熒光信號檢測便能顯示出已進行的所有必要的生理反應。這就意味著借助于測量就能允許毒素的有效檢測。
圖3.
脂質體檢驗系統能夠檢測出的肉毒毒素3種最重要的生理功能。毒素在脂質體膜表面上與受體結合后，pH值發生改變，使毒素中的輕鏈（LC）滲透到脂質體的內部中去。輕鏈會分裂出特殊的肽基，借助于酶的分裂作用可讀取在肽基上耦合的熒光分子。通過對熒光信號的量化，即可獲得活性毒素分子的數量信息。
檢測系統的進一步開發
當前該檢測系統尚處于起步階段，而相關的開發和優化工作已經啟動，旨在使其成為可靠的檢測方法，以便今后將其應用于含有BoNT的藥物制劑的檢測。一旦檢測滿足了審批當局的要求，就能夠取代傳統的老鼠半數致死量實驗法。甚至在將來還可以將其擴展應用于具有類似作用的毒素的檢測。
蘇黎世聯邦理工學院食品營養和健康研究所食品微生物教研室的Martin Lossner教授所領導的這一項目，得到兩個德國研究小組的支持：即來自哥廷根的miprolab公司和來自漢諾威的toxogen公司，同時還得到了來自瑞士聯邦人口保護局的Spiez實驗室的支持。此外，該項目還得到瑞士3R研究基金會的贊助。