凝膠柱干了就無法起到對分子隔離的作用了。
凝膠柱的原理就相當于固定相是一個“反篩子”尺寸比較大的分子因為無法進入凝膠內部，所以就從凝膠之間的空隙里面鉆下去了，所以跑得更快。
而尺寸小的分子則會進入凝膠上的微孔，不會太快被沖下來。這樣就可以按照分子的尺寸而將混合物分開。
凝膠柱干了，凝膠里面可能就會混進去非常多的氣泡，這樣產品就很難分開。對于一些要求高產率的課題來說，干一次柱子的結果可能是產率直接掉十個點、或者減半這樣的打擊非常致命。
凝膠層析是把樣品加到充滿著凝膠顆粒的層析柱中，然后用緩沖液洗脫。大分子不能進入凝膠顆粒中的靜止相中，只留在凝膠顆粒之間的流動相中。
因此以較快的速度首先流出層析柱，而小分子則能自由出入凝膠顆粒中，并很快在流動相和靜止相之間形成動態平衡，因此就要花費較長的時間流經柱床，從而使不同大小的分子得以分離。
商品凝膠的種類很多，常用的有葡聚糖凝膠（Sephadex G）以及羥丙基葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20)。