GPC的分離原理就是體積排阻理論。色譜柱中，所填裝的多孔性填料表面和內部有各種各樣、大小不一的空的通道，當高分子溶液試樣隨溶劑進入柱子后，由于存在濃度差（推動力），所有溶質分子都力圖向填料內部孔洞滲透。較小分子除了能進入較大的孔，停留時間適當短些；而最大的分子，只能從填料顆粒之間的空隙中通過，所以停留時間最短。隨著溶劑提洗過程的進行，經過多次滲透-擴散平衡，分子根據相對分子質量被分開，最大的聚合物分子從載體的粒間首先流出，依次流出的是尺寸較小的分子，最小的分子最后被洗提出來，這樣達到了大小不同聚合物分子分離的目的。