1. 如果凝膠過濾的介質是干粉，則需在凝膠過濾緩沖液中完全溶脹。
2. 在遠離過往通道及直接光照的恒溫環境，將層折柱垂直安裝在穩固的實驗室支架上。
3. 用一注射器將凝膠過濾緩沖液從柱子的輸出管注入柱子，至緩沖液達到柱子支持體平面之上，注射器留在輸出端以堵住柱子。
4. 沿著一根順柱子內壁而放的玻璃棒將凝膠混懸物倒入柱子至所設高度，再小心往凝膠頂部加入1 cm 高的一層緩沖液，并連接緩沖液貯存容器，取去堵著柱子輸出管的注射器，用2~3倍柱床體積的緩沖液請洗柱子。
5. 流盡柱子凝膠頂部上面的緩沖液、關閉其輸出管。
6. 加入相當于柱床體積1%~5%的蛋白質樣品。開放輸出管，讓樣品流進柱床，凝膠上面的柱子內壁以緩沖液沖洗。
7. 在凝膠頂上用吸管加入1 cm 高的緩沖液層，重新與緩沖液貯存容器連接，開始洗脫。
8. 分部收集流出液。每分部相當于1%總柱床體積，分別測每個分部的A280，并各取小份樣品測生物活性，選出有活性的分部用SDS-PAGE檢測所含蛋白質的數量和質量，合并含目標蛋白的分部。
9. 用2~3個柱床體積的凝膠過濾緩沖液洗柱，柱子保存在含0.02%疊氮鈉的緩沖液中，柱于可無限次地使用。