在臨床實驗室實行方法標準化及質量控制，始于臨床化學部門。該部分已有象國際臨床化學聯合會（IFCC）等國際學術組織在國外推選多年，并已有了一套完整的質量控制體系和成熟的經驗。美國的臨床化學家協會（AACC），早在1953年就編輯出版了第一部《臨床化學標準方法》(standard methods of clinical chemistry)；此后又連續出版多卷。[1]至于臨床化學質控的專著亦已出了好多部，大部分已在國內介紹并廣泛推行。在臨床血液學方面，雖然也有國際血液學標準化委員會（ICSH）和國際血栓與止血委員會（ICTH）等學術組織公布和推行過一些關于血液學檢驗方法標準化和質量控制的方案，但除了像血紅蛋白測定這一類似臨床化學的項目卓有成效以外，在其他方面尚不十分成熟，推行也不及臨床化學廣泛。
血栓與止血的實驗室檢查的臨床重要性與日俱增，檢驗內容不斷擴大，工作量也日益增多；不斷出現的方法革新和自動化，改變了以往單靠手工操作，自配試劑，工作效率低的局面。與些同時，要求方法標準化和實行質量控制的呼聲也愈來愈高。然而由于血液學檢查，特別是血栓與止血檢測的特殊性，迄今為止，除了凝血檢驗中的凝血酶原時間和活化的部分凝血活酶時間以及最近幾年對血漿纖維白原的測定有了標準化的試劑（如PT）、標準品（如纖維蛋白原）、質控品或統一的表達結果的報告方式等以外，其他方面，如血小板的功能測定、抗凝因子及纖溶相關因子的測定等尚未有成熟的方案。
本文僅就上述已較成熟，并經ICSH、ICTH或美國的國家臨床化驗室標準委員會（NCCLS）等以文件公布的PT、APTT和纖維蛋白原三項的標準化及質量控制作一介紹。不過，PT（一期法）和APTT是用功能測定（而非免疫學和化學測定）凝血因子的基礎，諸多凝血及部分抗凝因子的檢測是通過PT或APTT的基本方法來實現的。所以有了這一基礎，也便于實現上述各因子測定的標準化和質量控制。
凝血酶原時間（PT）
自從1935年 Quick 建立了PT測定方法以來，歷經60余年，經久不衰，至今它仍然是檢查所謂“外源”凝血途徑諸因子及相關抑制物的重要過篩試驗，并且是監控口服抗凝藥治療的主要手段。
PT測定受很多因素影響，諸如標本的采集方法及器材，貯血容器的性質，抗凝劑的種類和用量，標本的運送和貯存條件，孵育溫度及時間，凝血活酶試劑的種類和質量（敏感性）以及判讀終點的方法等，均會影響測定結果。此外，報告結果的方式也必須統一，特別是用于監控口服抗凝藥物治療時。所有這一切，都必須使方法標準化和建立有效的質量控制。
早在1973年，在維也納召開的第四屆血栓與止血國際會議上，由ICSH 和ICTH聯合成立了口服抗凝藥控制專家組（Expert Panel on Oral Anticoagulant Control），要求該組制訂推薦一個PT測定標準化方案。經過多個實驗室的協作研究，在1975年該專家組提出了第一個人血一期凝血酶原時間試驗參考方法(reference method for the one-stage prothrombin time test on human blood)并于1976年發表（編號ICSH-EP14/1：1975）。[2]該文件重點是講標本采集和PT的測定方法，對于報告結果和質量控制只簡單地提了幾句。而至關重要的PT試劑--凝血活酶的標準化問題，當時雖已注意到，但因條件尚未成熟，僅答應進一步研究完成后再修訂。眾所周知，不同的凝血活酶，檢測相關的凝血因子缺乏的敏感性是不同的。因此要使PT標準化，使不同的實驗室雖用了不同的凝血活酶，也能得到同樣的（可比的）結果。
此后，經過幾個著名實驗室歷時數年的共同努力，并用世界衛生組織（WHO）參與，以當時已在英國作為統一標準使用的“英國比較凝血活酶”(british comparative thromboplastin,簡稱BCT)為基礎，制備了WHO的原級凝血活酶參考品(primary reference preparaation)人腦制品，編號67/40；同時制備了牛腦（68/34）和免腦（70/178）兩個月67/40標化的次參考品(secondary reference preparation)。[3~4]后來，WHO又發表了其他一些次級參考品，迄今已在世界各國廣泛用于校正本地制備或工在生產的PT參考物。[5]
與此同時，在口服抗凝藥物治療中，用PT監控時的報告方式也列入了議事日程。如上所述，各種凝血活酶對凝血因子有不同敏感性。為了使不同敏感性的試劑得到同樣的測定結果，首先要制定一個共同的敏感性指標。這就要通過用自制的試劑與IRP進行比較后，得到一個校正值。具體的做法是：用多份口服抗凝藥后不同程度地缺乏凝血因子的病人血漿和正常對照（至少混合10個正常人）的血漿，同時用自制凝血活酶和國際參考品（IRP）測定PT（結果用秒表示），分別計算出各自與正常對照血漿的比率。然后在雙對數紙上作圖，以IRP的比率為縱坐標，自制凝血活酶的比率為橫坐標，通過回歸分析，其回歸線的斜率稱為國際敏感指數，簡稱ISI。此數值愈低PT試劑愈低敏感（人腦制的原級標準作為1.0） 。
從理論上講，不管何種凝血活酶，只要標上ISI，就可以與國際參考制品進行對比校正，并可用同一種計量單位報告。1985年，ICSH和ICTH發表了在口服抗凝藥監控中推薦的PT報告方式（即ICSH/ICTH
recommendations for reporting protrombin time in oral anticoagulant
control）。該文件提出用國際標準化比率（international normalized
ratil簡稱INR）來報告PT試驗結果，[6]INR的計算公式如下：
INR=PTR[S]
式中PTR表示患者的PT與正常對照PT的比值；ISI為國際敏感指數。
方件要求試劑廠家每批凝血活酶試劑都必須標明ISI值，以便使用者計算INR。目前各國在口服華法令類抗凝藥物時，已廣泛使用INR作為控制用藥量的指標，ICSH和ICTH已聲明，今后凡有關此種監控的論文，如不用INR表達PT結果，醫學科學刊物將不了予接受。
在用INR以后，各種敏感性不同的凝血活酶均可得到相同INR值，這對于用手工法（傾斜試管法）定PT值并用手工法測定PT來講是正確的。但后來發現，手工與儀器法以及儀器與儀器之間，INR仍有差別。為此Chantarangkui等提出建議，同一凝血活酶試劑用于不同的儀器時，可用所謂“儀器特有的ISI”（instrumrnt specific ISIs）來計算INR。WHO在發放IRP時，亦可附上這種儀器特有的ISI。[7]
除了ICSH、ICTH和WHO發布的有關PT測定標準化的文件以外，1992年美國的NCCLS也發表了編號為H28-T的有關PT測定標準化的文件。[8]本文以下將綜合上述文件，提出我國PT測定標準化和質量控制的方案，供討論。
一、原理
將凝血活酶（主要含組織因子和脂質）和鈣離子，加到枸櫞酸抗凝血漿中，在37℃保溫,測定血漿凝固時間,即為PT.本法主要用于過篩檢測外源凝血途徑的第VII、II、V、X因子和相關因子的抑制物。
二、試劑
1、抗凝劑：109mmo1/L枸櫞酸鈉液（相當于含二分子結晶水的櫞酸鈉32g/L）
2、凝血活酶試劑：市售商品，應標有ISI、批號及有效期。凍干者應按說明書加指定的緩沖稀釋劑復溶。
3、氯化鈣（CaCl2）溶液，濃度為25mmo1/L。
（目前有些商品試劑已將凝血活酶液與氯化鈣液混合好，可不必另配CaCl2液）
4、質控物，正常及異常對照血漿。
三、儀器
1、手工法：秒表，保持37℃±1℃的恒溫水浴箱或電熱塊。
2、儀器法：各種自動或半自動凝血儀，嚴格按說明書操作。
四、血液樣品的采集、運送及貯存
1、用一次性塑料采血器或硅化玻璃注射器。采血時止血帶不可束縛過緊，并不應超過5分鐘。（針管內見到血即應解開止血帶）否則某些凝血及纖溶因子會活化，并可能使Hct長高。
2、血與枸櫞酸鈉抗凝劑按9:1混合，輕輕顛倒混勻。可用特制的已加有定量枸櫞酸鈉液的抽空硅化管（國內已大量生產）采血，可保證血與枸櫞酸鈉比例準確，防止凝血因子活化，并保持清潔，防止試管和不合格橡皮塞的污染。
血液如發現凝固即應棄去不用，也不可污染組織液。
3、貯血應用塑料管或硅化試管（國內已有商品大量供應）或其他不沾濕的容器，避免接觸活化凝血因子。取得血液后應盡快送到血液檢驗室。在運送中應避免劇列振動和日光直射。一般要求自采血到測定在2小時內完成，不可久貯。如在室溫中貯存過久，第V因子等會破壞；另一方面，冷凍或在4℃貯存過久,會導致第VII因子活化,使PT縮短，有報道有些口服抗凝藥的患者，全血在4℃貯存2-4小時,其PT可接近正常.故實驗室在取得血樣后盡快離心,分離血漿并盡快測定。
4、標本制備
PT和APTT都應用乏血小板血漿（PPP），分離血漿時要求相對離心力2000-2500×g,離心30分鐘,用濁度法測定終點的自動化凝血儀,溶血和較明顯的黃疸及脂血均會影響測定結果,此時可用手工法或電子機械式凝血儀測定.
五、測定步驟
1、手工法
⑴測定溫度36.5-38.5℃，上述各試劑及被測血漿，均應預溫至此一溫度，但凝血活酶試劑預溫不可超過30分鐘，血漿預溫一般不宜超過10分鐘。
⑵所用試管及加樣器等接觸血漿的器具均應為塑料或硅化玻璃管。
⑶吸取枸櫞酸抗凝了血漿0.1ml,加入一小試管中；加入凝血活酶
試劑0.1.ml混勻后置37℃水浴中。再加入25mmo1/L CaCl2
液0.1ml,(也可先將凝血活酶試劑與CaCl2溶液等量混合,加入0.2ml)。立即混勻并不開動秒表；試管仍浸于水浴中；，至約10秒鐘時，自水浴中取出，在紗布上迅速擦去試管外水滴，在明亮處不斷傾斜試管，在流動狀態下觀察有無纖維蛋白形成。一旦見到纖維蛋白（同時將出現液體流動減慢），立即停表，記錄時間。每次測定二管，按平均數報告。
本試驗的最后混合液其中PH 應為7.2-7.3，大部分商品凝血活酶試劑均用含緩沖液的溶液配制。
⑷每批均應同時做正常和異常對照，方法應與測定標本完全相同。
2、儀器法
凝血測定儀大體上可分為光電濁度和電子機械法兩大類，自動化程度也不一樣。一般儀器均供應配套試劑，各有詳細說明書，應嚴格按說明書操作。
六、報告
1、以PT的秒（S）數報告（最接近的0.5秒）。
2、以患血漿PT（S）/正常對照PT(S)的比率（PRT）報告。
3、在口服華法令類抗凝藥物治療監控時，應報告國際標準化比率，INR。大部分自動化化儀器可根據所測的PTR和凝血活酶試劑的ISI，自動算出INR。手工法可根據下列公式，有一計算器直接計算：
INR=PTRISI
INR=Antilog(ISI×logPTR)
用計算器計算時，先輸入PTR值，繼按lg鍵，再按×鍵后輸入ISI值,接著按10X鍵(或按INV鍵后按10x鍵,或按第二功能鍵后再按lg鍵)即可得INR值。
Poller設計了一個簡便的列線圖，在取得PTR和ISI值后，即可從圖上直接查出INR值，十分便利，國內已有介紹。[9，10]
ICSH規定，不再用稀釋曲線或百分比（活動度）報告。[6]
七、參考值（范圍）
因儀器/試劑不同，會得出不同結果，故很難統一規定參考值。各實驗室應根據自己的儀器、試劑等條件，自行測定一批健康人，建立參考值。此后至少每年或當條件有變化時，根據新的條件，重新建立。PT測定的一切條件均應與患者血漿PT測定相同（包括采血、容器、抗凝劑等）。健康供血者應選至少20個18-55歲的男性和非妊娠、月經期女性，不可服藥，在平靜休息狀態采血，以減少個體差異（有條件時，可測一批老年人和小兒，分開統計）。同時應分開幾天采血和測定，以減少天間差異。測定結果經統計學處理，計算標準差；以兩個標準差（2SD）或95%可信限作為參考范圍。對于三個標準差是正常還是差異常，需結合具體情況進行評價。從統計學上講，其中有些人是正常的。用以上標準，病人（PT異常）則很少會遺漏。
八、質量控制
1、室內控制：每天開始，（工作量大的單位每40個樣本一批）都必需用正常和異常對照血漿進行核對。這種血漿有商品供應，自制時正常血漿與上述參考血漿制備法相同。異常血漿則采用口服華法令類抗凝藥，導致一個或一個以上因子部分缺乏，PT比正常對照延長1.5-2倍的患者血液，完全按上述制備血漿相同的條件制備，冰凍或凍干保存。但應注意，有些凍干品復融后會有混濁，影響濁度法自動血凝儀的測定。如發現有出控現象（超過原標定的平均數+2SD），應逐一檢查儀器、試劑和質控血漿有無問題并加以校正。否則不能發出報告。
目前尚PT的血漿標準品，上述對照（質控）血漿主要供各實驗室自己核查、校對用。
2、可接受的變異性（acceptable variability）
對于同一批質控血漿，分析系統中的試劑、儀器、加（取）樣裝置以及定時器等總的天與天之間的變異系數（不精密度）CV不得超過5%。
3、重復實驗的變異系數（coefficient of variation for replicate test）
同份標本測定兩次（下稱雙份測定），其差值的大小，可用來評價分析系統的批內精密度。正常血漿及異常（比正常延長1-2倍）血漿的雙份測定，其CV 不應超過5%。
4、雙份測定重現性（reproducibility of duplicate）
雙份測定之間的差值的大小，通常用來作為結果可接受性的標準。此點有助于核查系統不精密度和/或偶然的分析誤差。雖然這種由操作構成的差值的大小會因所用分析系統不同而有所變化，一般用雙份測定之間的兩次測定平均差10%作為可接受的標準。
5、室內質評：各實驗室必需積極參加由檢驗中心組織的室間質評活動，以便及時了解本單位PT測定的準確性。雖然因儀器和試劑不同，同一份質控血漿可得到不同的結果，但用手工法，同一試劑結果是一致的。此外，不同類型的儀器/試劑，如分開統計，也有一定可比性。故回報時，應將儀器型號和試劑廠牌及批號等附上，以供比較。
九、造成結果錯誤的各種原因
1、樣器(Specimen)或標本（Sample）有關的問題
⑴血樣收集管注入血液過多或不足。
⑵患者紅細胞比積>0.55%時未校正枸櫞酸鹽液體積.
⑶用了不正確的抗凝劑(如EDTA或草酸鹽)或未加抗凝劑,或濃度不準確.
⑷用了已凝固、溶血、黃疸或脂血樣品
⑸血樣混勻不當或太劇烈的混勻。
⑹采血品或貯血管不潔，已受到污染。
⑺污染了肝素。
2、分析前的錯誤
血樣送驗延誤或用了不合規定的方法運送、處理或貯存血樣。
3、與試劑有關的問題
⑴試劑已被污染
⑵復溶時稀釋劑加量不準確.
⑶復溶時未用推薦的試劑。
⑷試劑在運輸、貯存過程中，由于處理不當而變質。
⑸試劑復溶后超過了規定的穩定期或試劑已超過有效期。
4、分析過程的錯誤
如孵育時間不準確：溫度、加試劑量以及儀器操作布驟不準確等。
最后是安全性問題：由于接觸血液有可能導致HIV、HBV或HCV的感染。國外對實驗室工作人員的安全防護極為重視，在其操作規程中都將安全防護列為重要項目，PT和APTT的測定也不例外。在采集、運送及處理血樣時，隨時都要防止血樣污染人體。操作中盡可能要戴手套。用一次性采、貯血樣器具，用完后按規定消毒處理等。
活化的部分凝血活酶時間（APTT）
APTT是檢測內源途徑凝血因子缺陷和相關抑制物（包括狼瘡抗凝因子）的試驗，也是當前用于凝血因子治療及肝素抗凝治療監控的主要手段；其臨床應用頻率僅次于PT或與之相當。
APTT是從復鈣時間和部分凝血活酶時間（PTT）改良而來。它用磷脂作為血小板代替物，加到去血小板血漿中，同時加入了活化第VII因子的激活劑。較之PTT，其凝固時間縮短，并且排除了血小板數量和功能對血漿凝固的影響。
和PT測定一樣，不同的部分凝血活酶試劑對肝素和各種凝血因子缺陷的敏感性相差很大；不同的激活劑及激活時間對測定結果也很大影響。迄今為止，ICSH和ICTH尚未有APTT測定標準化或試劑標準化的方案，僅NCCLS于1992提出了一個編號為H29-T的暫行方案。[11]
1994年Reed等組織了13個實驗室（中心）協作，試圖將PT測定用的ISI和INR 體系用于標化APTT試劑，以便用肝素治療的臨控，結果大失所望。[13]他們用在體外加入不同量肝素的凍干血漿（體外肝素血漿）、新鮮血漿和接受肝素抗凝冶療，血漿中含有肝素的血漿（體內肝素血漿），按PT標化凝血活酶試劑的方法進行測定，結果發現，各種部分凝血活酶試劑，其體外肝素血漿和體內肝素血漿的敏感性有很大差別。他們用了五個試劑，也用ISI來統一標化，結果不成功。因為無論用哪一個試劑作標準，實驗室之間差別都很大。正常及病人血漿凝固時間的回歸線往往不平行或偏斜。因此認為用這種方法標化部分凝血活酶不理想。而1995年Vander velde 和 poller由 ISTH/ICSH組織協作研究用APTT監測肝素的標準化，[13]所得結果有所不同（所有的方法基本相似），他們選用的三個試劑中，有兩個幾乎同樣地好，其中一個被選作參考試劑。但他們也不主張用單一標上b值（校正常數，即病人和正常血漿回歸線的斜率）的試劑，供所有實驗室使用，而要各實驗室自己標定自己的試劑。總之，APTT試劑和測定的標準化還遠未成熟。以下就NCCLS推薦的方法，結合其它資料作一介紹，供國內APTT測定標準化參考。
一、原理
將一種磷脂和激活劑加到血漿中，經過孵育后，加入適當濃度的鈣離子。其纖維蛋白凝塊形成的時間（以秒計），即為APTT。本法主要用于過篩測定內源途徑凝血因子和共同途徑因子的缺陷，如因子XII、VIII、IX、PK、HMWK以及纖維蛋白原等。同時也用于上述因子的抑制物測定、肝素治療的監測以及狼瘡抗凝因子的檢查。
二、儀器
本法所用儀器、設備（包括采血、貯血容器、加樣裝置等）以及對它們的要求完全與PT相同。PT 所用自動化儀器同樣適于本法。
三、試劑
1、部分凝血活酶試劑（一種腦磷脂）由商品供應，一般已與激活劑按比例配在一起（或分開配制），常用的激活劑有硅藻土（商品名Celite）、白陶土、二氧化硅微粒、鞣化酸（ellagicacid）或其它可用的激活劑，由廠方配套供應。
APTT試劑儀器結合，應能使第VIII、IX或因子活性低于0.3/ml(或<30%)的血漿,出現異常延長的結果。
2、氯化鈣溶液（25mmol/L）以及其它試劑與PT所用者相同。
四、測定步驟
1、樣品的采取、貯存、運送與PT測定同。注意，應用清潔的塑料或硅化玻璃采血器采血及貯血。
2、標本（去血小板的血漿）的制備與PT同。注意，應用去血小板血漿測定。
3、水浴箱或電熱塊的溫度為37±1℃，要經常檢查是否準確。
4、接觸活化時間：加激活劑活化XII因子的時間要保持一致。各儀器和試劑生產廠家的規定可能不一樣，應嚴格按說明書要求進行。手工操作時，應用秒表或類似的定時裝置計時。
5、操作
預溫（不超過30分鐘）APTT試劑一份與預溫（不超過10分鐘）的待測血漿一份混合，立即開動秒表計時。至規定的接觸活化時間終點時，加入預溫37℃的CaCl2液一份,混勻,同時開動秒表。至出現血漿凝固時，停表，計錄血漿凝固時間（以秒計）。手工測定時應同時測定兩管，按平均數報告。一些精密度已有很大改進的自動或半自動凝血儀，如果有適當的質控標準也可只測定一次。此外，應同時測定正常和異常對照血漿。
五、對肝素的敏感性
APTT常用于肝素治療的監測，通常以患者APTT與正常血漿APTT的比率在1.5-2.5作為治療控制范圍。但不同的試劑/儀器系統對肝素的敏感性不同，其試劑/儀器系統對肝素的敏感性可進行測定。體外的敏感性（invitro
sensitivity）是指將臨床在使用的同類型的肝素按其治療濃度，加到正常血漿中，測定APTT。體外敏感性與體內(invivo)敏感性不等同，但可作參考。
六、狼瘡抗凝因子
狼瘡抗凝因子是一種抗磷脂的自身抗體，由于它抗凝血的重要成分磷脂，故能干擾凝血。血中如存在狼瘡抗凝因子，APTT將延長。但APTT試劑對狼瘡抗凝因子敏感或不敏感有很大差別，試劑制造廠家應提供足夠的說明，有關的國家機構也可提供對狼瘡因子第三性差異的資料。但要知道，病人個體之間也有很大差異（雜合性），沒有一種試劑能測出所有狼瘡抗凝因子。
關于APTT參考值的建立、質控物制備、質控方法以及差錯產生的原因等，與PT測定完全一樣，請參閱PT測定有關部分。
附：凝血因子缺陷與循環存在抗凝物的簡易鑒別方法，取病人及正常人新血漿，分別按下述體積混合：
血 漿 試 管
1 2 3 4 5
正常人ml 0.0 0.1 0.25 0.4 0.5
病 人ml 0.5 0.4 0.25 0.1 0.0
完全混勻后，在37℃水浴中保存，測定前再混勻。將各管混合血漿，分別測定APTT各兩次。余下的混合血漿仍置37℃,一小時再重復測定,每管測兩次.
結果解釋：加入含50%正常血漿（即第3管），APTT仍延長者，可能存在抑制物。如加入20%病人血漿（第4管）使正常血漿APTT明顯延長者，提示病人血漿可能存在抑制物。有些抑制物需在37℃孵育1小時后才表現抑制作用(如第VIII因子抑制物)，而狼瘡抗凝因子則兩者無差別。如加入正常血漿后，病人的APTT延長被糾正，則可能是由于凝血因子缺陷，而非抑制物所引起。