凝集反應實驗_微量滴定凝集法

微量滴定凝集法（microtiter agglutination），它可利用已知抗原測定入體內抗體的水平（效價），也是診斷腸道傳染病的重要方法，例如診斷傷寒、副傷寒的肥達（Widal）氏反應即為一種定量凝集反應。假如在一個病入的病程中做幾次試驗，其效價是逐步上升的，則表示病入患的是試驗中所用微生物所引起的傳染病。

血清學反應的基本組成成分除抗原與相對應的抗體外，尚需加入電解質（一般用生理鹽水）。電解質的作用主要是消除抗原抗體結合物表面上的電荷，使其失去同電相斥的作用而轉變為互相吸引，否則即使抗原與抗體發生結合亦不能聚合成明顯的肉眼可見的反應物。

在一系列稀釋的血清中（例如 1：5、1：10、1：20、1：40……），能與抗原發生明顯凝集反應的最高稀釋度的倒數，即為該免疫血清的效價。假如從 1：5 至 1：20 三個稀釋度有凝集反應，1：40 的無凝集反應，則血清效價為 20。

大腸桿菌懸液

大腸桿菌免疫血清生理鹽水

微量滴定板微量吸管（20～80 ul）微量吸管的吸嘴

1. 稀釋血清（兩倍稀釋）

1.1 在微量滴定板上標記 10 個孔，從 1 至 10（如圖 1）。

圖 1　抗血清稀釋圖

1.2 用微量吸管（套上吸嘴）于第 1 孔中加 80 ul 生理鹽水，其余各孔加 50 ul。

1.3 加 20 ul 大腸桿菌抗血清于第 1 孔中。

1.4 換一新的吸嘴，在第 1 孔中吸上、放下來回三次以充分混勻，再吸 50 ul 至第 2 孔。換吸嘴，同樣在第 2 孔吸上、放下，三次后吸 50 ul 至第 3 孔，依次類推，一直稀釋至第九孔，混勻后棄去 50 ul 稀釋后的血清稀釋度見表 1。

表 1　抗血清稀釋表

2. 加菌液

每孔加大腸桿菌懸液 50 ul， 從第 10 孔（對照孔）加起，逐個向前加至第 1 孔。

3. 將滴定板按水平方向搖動，以混和孔中內容物。然后將滴定板放 35℃ 下 60 min， 再放冰箱過夜。

4. 觀察結果

觀察孔底有無凝集現象，陰性和對照孔的細菌沉于孔底，形成邊緣整齊、光滑的小圓塊，而陽性孔的孔底為邊緣不整齊的凝集塊。亦可借助解剖鏡進行觀察。當輕輕搖動滴定板后，陰性孔的圓塊分散成均勻混濁的懸液，陽性孔則是細小凝集塊懸浮在不混濁的液體中。