出色靈敏度提升復雜基質中目標肽段定量能力（二）

高效液相色譜分離

高效液相色譜儀: Thermo Scientific EASY-nLC 1000

預柱：Dionex PepMap C18 色譜柱（2cm, ID75μm, 3μm）

分析柱：Dionex PepMap C18 色譜柱（15cm, ID75μm, 3μm）

流動相：A，含0.1% 甲酸的水溶液；B，含0.1% 甲酸的乙腈溶液

梯度： 2%-5% B 2 min，2%-45% B 42min，45%-90% B 3 min，90%B 3min

流速：300 nL/min

上樣量: 2 μL

質譜分析

質譜儀：Thermo Scientific TSQ Quantiva

離子源：NanoFlex 離子源

離子模式：正離子

噴霧電壓：2.0 KV

毛細管溫度：275 ℃

Q1 and Q3 resolution: 0.7 Da;

Cycle time：2s

碰撞能量：通過公式CE=0.034 × 母離子的m/z + 5.314 計算得到相應肽段的碰撞能量，并在此基礎上CE加減2 進行進一步優化，選擇最優碰撞能量。

實驗結果

本實驗采用全新一代三重四極桿質譜TSQ Quantiva 對復雜基質中15 條重標肽段進行定量分析，均可獲得良好的色譜峰形和質譜響應（圖3）。以肽段SSAAPPPPPR* 為例，檢出限為（LOD）1amol，定量下限（LLOQ）為5amol（圖4）。如圖5 標準曲線所示，在5amol-100fmol 五個數量級濃度范圍內，濃度與峰面積的線性相關系數在0.99 以上，同時，在amol 級水平仍可獲得良好重復性（圖6）。15 條肽段的標準曲線和線性范圍參見表2。

圖3. 15 條肽段總離子流圖（TIC）（上樣量100fmol）

圖4. 肽段SSAAPPPPPR* 不同上樣量提取離子流圖（EIC）m/z493.8-> m/z 335.7

圖5. 肽段SSAAPPPPPR* 標準曲線

圖6. 肽段SSAAPPPPPR* 在amol 水平重復性

表2. 15 條肽段標曲和線性范圍

結論

實驗表明，得益于主動離子管控技術（AIM），TSQ Quantiva在復雜基質中針對目標肽段的定量靈敏度表現突出，極大地提升了TSQ 質譜平臺定量復雜基質中目標肽段的能力，適用于復雜生物學樣本中低豐度蛋白質的分析，可用于潛在生物標志物的確證工作。