13．連接產物轉化DH5α（預開42C水浴）
與T載體轉化相同，先轉化DH5α，篩選及擴增目的重組質粒
轉化DH5α后挑6～8個菌落驗證，驗證項目：
1． 目的基因引物PCR驗證
2． 表達載體引物PCR驗證
3． Step2中PCR產物膠回收后，以膠回收為模板、基因引物進行nest PCR
4． 小抽雙酶切驗證
驗證后再小量抽提質粒，保存50ul質粒及相應的DH5α細菌
小抽重組質粒轉化表達菌BL21。轉化BL21后只需基因引物PCR驗證
目的基因表達
14．快速誘導表達
快速誘導目的是為檢測該重組質粒在BL21中是否能被誘導表達重組蛋白，并確定在不同IPTG濃度蛋白誘導效率的差異。
5． 挑單克隆菌落于7ml含有相應抗生素LB培養液的50ml培養管中，37C振蕩培養過夜（8-16h）。
6． 37C，1mM
IPTG終濃度誘導蛋白。取700ul過夜搖菌加入7ml含有相應抗生素LB培養液的50ml離心管中，于OD600＝0.4-0.6（1:100接種，37C培養時，細菌生長至OD600＝0.4-0.6約需2h）時加入終濃度為1mM的IPTG。
7． 誘導前在37C培養的菌液中取1ml未誘導的對照，按1ml菌液×OD600×100μl的比例(如1ml OD600為0.4的菌加40ul
buffer)加入2×上樣緩沖液，混勻，-20℃保存或直接上樣。
8． 根據蛋白分子量大小配置相應濃度的SDS-PAGE膠。（50KD蛋白10％或12％）
9． 誘導3-4h后收集菌液，取1ml樣品，測OD600，10000rpm，1min離心去上清后加入相應體積的2×上樣緩沖液，vortex。
10． 將收集的菌液在水中煮5min，上樣10μl ，120V電壓走濃縮膠，加電壓至150V進入分離膠電泳，直到染料剛好走到膠底。
11．
取下膠，考馬斯亮藍染色至少30min（染液若是新配的，染20min就夠了），脫色液脫色。若急需看到結果，可以將膠在500ml蒸餾水中煮沸兩次即可看到條帶。
注意：
a.記錄誘導后菌液的OD600
b.SDS-PAGE結果確定蛋白誘導后，再進行低溫小量蛋白表達
c.制備的兩個重組表達載體可同時進行快速誘導