實驗概要
Northern雜交采用瓊脂糖凝膠電泳，將分子量大小不同的RNA分離開來，隨后將其原位轉移至固相支持物（如尼龍膜、硝酸纖維膜等）上，再用放射性（或非放射性）標記的DNA或RNA探針，依據其同源性進行雜交，最后進行放射自顯影（或化學顯影），以目標RNA所在位置表示其分子量的大小，而其顯影強度則可提示目標RNA在所測樣品中的相對含量（即目標RNA的豐度）。但與Soughern雜交不同的是，總RNA不需要進行酶切，即是以各個RNA分子的形式存在，可直接應用于電泳；此外，由于堿性溶液可使RNA水解，因此不進行堿變性，而是采用甲醛等進行變性電泳。雖然Northern也可檢測目標mRNA分子的大小，但更多的是用于檢測目的基因在組織細胞中有無表達及表達的水平如何。
主要試劑
1. 0.5M EDTA: EDTA 16.61g加ddH2O至80ml, 調pH至8.0, 定容至100ml。
2．50mM NaAc: NaAc 3.4g 加ddH2O至500ml, 加DEPC 0.5ml, 振蕩, 37℃過夜，高壓滅菌。
3． 5×甲醛凝膠電泳緩沖液: MOPS [3-(N-瑪琳代)丙磺酸] 10.3g加50mM NaAc 400ml, 用2N NaOH調pH至7.0, 再加入0.5M EDTA 10ml, 加DEPC H2O至500ml。無菌抽濾，室溫避光保存。
4． 20×SSC: NaCl 175.3g、檸檬酸三鈉88.2g，加ddH2O至800ml，用2N NaOH調pH至7.0，再用ddH2O定容至1000ml。DEPC處理、高壓滅菌。
5. 6×SSC: 20×SSC 300ml加ddH2O至1000ml。DEPC處理,高壓滅菌。
6．50×Denhardt : 聚蔗糖0.5g、聚乙烯吡咯烷酮0.5g、牛血清白蛋白(BSA)0.5g加dd H2O至50ml,無菌抽濾、分裝。
7．1M Na2HPO4: Na2HPO4?12H2O 35.81g, 加dd H2O至100ml。
8. 1M NaH2PO4: NaH2PO4?2H2O 15.6g, 加dd H2O至100ml。
9. 0.1M 磷酸鈉緩沖液(pH 6.6): Na2HPO4 35.2ml加NaH2PO4 64.8ml 。
10.STE緩沖液: 1M Tris-HCl(pH 8.0) 2.5ml,0.5M EDTA, 0.5ml,5M NaCl 5ml，加dd H2O至250ml。
11.預雜交液: 20×SSC 5ml,甲酰胺10ml,50×Denhardt 4ml,1M磷酸鈉緩沖液0.2ml（pH6.6）,10%SDS 1ml, 總體積 20ml。臨用前加入變性鮭魚精DNA（10mg/ml）,使終濃度為4μl/ml。
12. DEPC H2O: 1000ml ddH2O中加入DEPC 1ml，充分振蕩，37℃過夜，高壓滅菌。
實驗步驟
1. 總RNA提取
2. 變性膠的制備：取瓊脂糖0.2g，加入DEPC H2O 12.4ml，加熱熔化，于保溫狀態下加入5×甲醛凝膠電泳緩沖液4.0ml、37%甲醛3.6ml，混勻、制膠。待膠凝固后，置1×甲醛凝膠電泳緩沖液中預電泳5min。
3. 樣品制備：取總RNA 30μg，加入甲醛4.0μl、甲酰胺12.5μl，上樣緩沖液2.5μl。65℃溫育15min，迅速冰浴5min。然后加入5×甲醛凝膠電泳緩沖液 4.0μl
4. 電泳：上樣，50V電泳（電泳時間約2hr左右）。以1×甲醛凝膠電泳緩沖液為電泳液，電泳結束后轉膜。
5. 將RNA從變性膠轉移到硝酸纖維素膜或尼龍膜：
（1）．在一個標準變性凝膠電泳完成后，凝膠用DMPC-H2O淋洗，以除去甲醛，然后置于 2×SSC（20×SSC用DMPC-H2O稀釋）中浸泡15～30min.。
（2）．構建轉移平臺：在塑料盒上橫放一塊玻璃板，玻璃板應比塑料盒長，但比塑料盒窄。剪一塊與盒子等寬但長度是盒子長度2倍的濾紙，將其橫放在玻璃板上，濾紙兩頭垂入盤中，用20×SSC浸濕濾紙，并向盤中加入足量的20×SSC。
（3）．用鋒利的小刀將凝膠邊緣無用部分修去，并在靠加樣孔的一放左上角切去一小塊作為凝膠方位的記號。將凝膠置于平臺中央，用玻棒滾動除去氣泡，然后用石蠟膜封住凝膠四周邊緣，避免覆蓋樣品部位。
（4）．剪一片與凝膠暴露面同樣大小的尼龍膜，在無RNase的水中浸泡5min.，然后將其放置在凝膠上面，膜的一條邊緣應剛好重疊覆蓋于加樣孔的邊緣。膜置于凝膠表面后即不應輕易挪動，膜與凝膠之間不應留有氣泡。
（5）．取兩張與尼龍膜同樣大小的濾紙，用20×SSC浸濕后置于膜的上方，用玻棒趕出氣泡。切一疊略小于濾紙的紙巾，將其置于濾紙上方，在紙巾上平放一玻璃板，然后在玻璃板上壓一重物，室溫下轉膜4～6小時或4℃過夜。
在轉膜過程中，要保證塑料盤中有足夠的20×SSC，當紙巾浸濕后，要及時更換。
（6）．拆卸轉膜裝置，翻轉凝膠和膜使凝膠的一面朝上，置于一張干的濾紙上，用軟鉛筆在膜上標記凝膠加樣孔的位置。
(7)．取下凝膠，用2×SSC洗膜，再置于兩張干濾紙上使膜晾干。
(8)．交聯：將膜置于一可透過紫外線的塑料保鮮膜中，將有RNA的一面朝下，用紫外透射儀照射3min。帶正電荷的尼龍膜適度照射可促進RNA上小部分堿基與尼龍膜表面帶正電荷的胺基形成交聯結構，從而增強雜交信號。但過度照射確會使RNA上更大一部分胸腺嘧啶共價結合于尼龍膜表面，導致雜交信號減弱。
6. 探針標記(Prime-a-Gene Labeling System, Promega公司)：
（1）取模板DNA 25ng于0.5ml離心管中，95-100℃變性5min，冰浴5min。
（2） dNTPmix的制備: 取dGTP 1μl、dATP 1μl、dTTP 1μl混勻。
（3）將下列反應成份混合，加入上述微量離心管中：
dNTPmix 2.0μl
BSA(10mg/ml ) 2.0μl
5×buffer 10.0μl
Klenow 酶(5u/μl) 1.0μl
α-32P-dCTP 5.0μl
加入適量dd H2O使反應總體積達50μl，輕輕混勻。室溫下反應1hr。
7.預雜交：將膜的反面緊貼雜交瓶，加入預雜交液5ml，42℃預雜交過夜。
8.雜交：將變性的探針（95-100℃變性5min，冰浴5min）加入到預雜交液中，42℃雜交16hr。
9.洗膜：
(1)傾去雜交液。
(2)2×SSC/0.1%SDS，42℃洗10min。
(3)1×SSC/0.1%SDS，42℃洗10min×2次。
10.壓片：將膜用dd H2O漂洗片刻，用濾紙吸去膜上水份。用薄型塑料紙將膜包好，置于暗盒中，在暗室中壓上X光片。暗盒置-70℃放射自顯影一星期左右。
注意事項
(1)．操作時必須仔細、小心，嚴格按同位素操作規程進行，以防止同位素污染。
(2)．膜的重復使用：結合了待測RNA的膜與探針雜交后，可經堿或熱變性方法將探針洗脫，膜可反復使用與其它探針雜交。方法如下：雜交的膜（注意：雜交過的膜在保存過程中不能干燥，否則探針將會與膜形成不可逆的結合）置含1% SDS的沸水中自然冷卻至室溫后，將膜放入雙蒸水中漂洗2-3遍。取出膜，用濾紙吸去膜表面的水份。將膜直接進行另一種探針的雜交或用保鮮膜包好，室溫下真空保存。