實驗概要
將待檢測的DNA樣品固定在固相載體上，與標記的核酸探針進行雜交，在與探針有同源序列的固相DNA的位置上顯示出雜交信號。通過Southern雜交可以判斷被檢測的DNA樣品中是否有與探針同源的片段以及該片段的長度。該項技術廣泛被應用在遺傳病檢測、DNA指紋分析和PCR產物判斷等研究中。但由于該技術的操作比較煩瑣、費時，所以現在有一些其他的方法可以代替Southern 雜交。但該技術也有它的獨特之處，是目前其他方法所不能替代的，如限制性酶切片段的多態性(RFLP)的檢測等。
主要試劑
１．0.25M的HCl：21.55ml濃鹽酸定容至1000ml。
２．0.4M NaOH。16g NaOH溶于800ml蒸餾水，定容至1000ml。
3. 10% SDS：10g SDS溶于80ml蒸餾水，定容至100ml。
4．20×SSC: NaCl 175.3g、檸檬酸三鈉88.2g，加ddH2O至800ml，用2N NaOH調pH至7.0，再用ddH2O定容至1000ml。DEPC處理、高壓滅菌。
5．50×Denhardt : 聚蔗糖0.5g、聚乙烯吡咯烷酮0.5g、牛血清白蛋白(BSA)0.5g加dd H2O至50ml,無菌抽濾、分裝。
6．1M Na2HPO4: Na2HPO4?12H2O 35.81g, 加dd H2O至100ml。
7. 1M NaH2PO4: NaH2PO4?2H2O 15.6g, 加dd H2O至100ml。
8. 0.1M 磷酸鈉緩沖液(pH 6.6): Na2HPO4 35.2ml加NaH2PO4 64.8ml 。
9.預雜交液: 20×SSC 5ml,甲酰胺10ml,50×Denhardt 4ml,1M磷酸鈉緩沖液0.2ml（pH6.6）,10%SDS 1ml, 總體積 20ml。臨用前加入變性鮭魚精DNA（10mg/ml）,使終濃度為4μl/ml。
實驗步驟
1、基因組DNA的制備
2、基因組DNA的限制酶切
根據實驗目的決定酶切DNA的量。一般Southern雜交每一個電泳通道需要5-10μg的DNA。購買的限制性內切酶都附有相對應的10倍濃度緩沖液，并可從該公司的產品目錄上查到最佳消化溫度。為保證消化完全，一般用2-4U的酶消化1μg 的DNA。消化的DNA濃度不宜太高，以0.5μg /μl 為好。由于內切酶是保存在50%甘油內的，而酶只有在甘油濃度<5%的條件下才能發揮正常作用，所以加入反應體系的酶體積不能超過1/10。
具體操作如下：在1.5ml離心管中依次加入
DNA（1μg /μl） 5 μg
10×酶切buffer 5.0 μl
限制性內切酶（10U/μl） 5.0 μl
加ddH2O 至 500 μl
在最適溫度下消化24-30hr。消化結束時可取1μl電泳檢測消化效果。如果消化效果不好，可以延長消化時間，或者放大反應體積，或者補充酶再消化。如仍不能奏效，可能的原因是DNA樣品中有太多的雜質，或酶的活力下降及溶解蛋白質的污染。
消化后的DNA加入1/10體積 3M的NaAC，2倍體積乙醇沉淀，超純水溶解（離心轉速要提高到12000g，以防止小片段DNA的丟失）。
如果需要兩種酶消化DNA，而兩種酶的反應條件可以一致，則兩種酶可同時進行消化；如果反應條件不一致，則先用需要低離子強度的酶消化，然后補加鹽類等物質調高反應體系的離子強度，再加第二種酶進行消化。
3、基因組DNA消化產物的瓊脂糖凝膠電泳
瓊脂糖凝膠電泳是目前分離核酸片段最常用的方法，制備簡單，分離范圍廣（200bp-50kb），實驗成本低。下表列舉了不同濃度瓊脂糖凝膠能分離的DNA片段范圍。 一般用1%的TAE或者是0.5%的TBE作為電泳緩沖液。
表：不同濃度瓊脂糖凝膠分離DNA片段的范圍
瓊脂糖凝膠濃度（%） 分離DNA片段范圍（kb） |
0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 |
（1）. 制備0.8%凝膠：一般用于Southern雜交的電泳膠取0.8%的。
（2）. 電泳：電泳樣品中加入6×Loading 緩沖液，混勻后上樣，留一或兩泳道加DNA Marker。1-2V/cm，DNA從負極泳向正極。25v過夜電泳至溴酚藍指示劑接近凝膠另一端時，停止電泳。取出凝膠，紫外燈下觀察電泳效果。在膠的一邊放置一把刻度尺，拍攝照片。正常電泳圖譜呈現一連續的涂抹帶，照片攝入刻度尺是為了以后判斷信號帶的位置，以確定被雜交的DNA長度。
4、DNA從瓊脂糖凝膠轉移到固相支持物
轉移就是將瓊脂糖凝膠中的DNA 轉移到硝酸纖維膜（NC膜）或尼龍膜上，形成固相DNA。轉移的目的是使固相DNA與液相的探針進行雜交。常用的轉移方法有鹽橋法、真空法和電轉移法。這里介紹經典的鹽橋法（又稱為毛細管法）。
（1）試劑準備
a．脫嘌呤：0.25M的HCl。
b．變性液：0.4M NaOH。
c．轉移液：0.4M NaOH
（2）操作步驟
a.脫嘌呤:將凝膠轉移到0.25M的HCl 直到前沿溴芬藍變黃。
b.堿變性:室溫下將凝膠浸入數倍體積的變性液中到溴芬藍恢復藍色。
c轉移：按凝膠的大小剪裁NC膜或尼龍膜并剪去一角作為標記，浸入轉移液中5min。剪一張比膜稍寬的長條Whatman 3mm濾紙作為鹽橋，再按凝膠的尺寸剪3-5張濾紙和大量的紙巾備用。（ 為了保證轉移完全，轉移過程一般需要2天左右，每隔數hr換掉已經濕掉的紙巾。轉移液用0.4M NaOH。注意在膜與膠之間不能有氣泡。整個操作過程中要防止膜上沾染其他污物。）
d. 轉移結束后取出NC膜，浸入2×SSC溶液數min，洗去膜上沾染的凝膠顆粒，包上保鮮膜，紫外下交連3min，然后置與-20℃保存。
5、探針標記
進行Southern 雜交的探針一般用放射性物質標記或用地高辛標記。放射性標記靈敏度高，效果好；地高辛標記沒有半衰期，安全性好。這里介紹放射性標記。
探針的標記方法有隨機引物法、切口平移法和末端標記法，有一些試劑盒可供選擇，操作也很簡單。
以下是Promega公司的Prime-a-Gene Labeling System：
（1）取模板DNA 25ng于0.5ml離心管中，95-100℃變性5min，冰浴5min。
（2） dNTPmix的制備: 取dGTP 1μl、dATP 1μl、dTTP 1μl混勻。
（3）將下列反應成份混合，加入上述微量離心管中：
dNTPmix 2.0μl
BSA(10mg/ml ) 2.0μl
5×buffer 10.0μl
Klenow 酶(5u/μl) 1.0μl
α-32P-dCTP 5.0μl
加入適量dd H2O使反應總體積達50μl，輕輕混勻。室溫下反應1hr。
6、雜交
Southern 雜交一般采取的是液-固雜交方式，即探針為液相，被雜交DNA為固相。雜交發生于一定條件的溶液（雜交液）中并需要一定的溫度，可以用雜交瓶或雜交袋并使液體不斷的在膜上流動。雜交液可以自制或從公司購買，不同的雜交液配方相差較大，雜交溫度也不同。下面給出的為一雜交液配方：
6×SSC，0.5%的SDS，5×Denhandt試劑。該雜交液的雜交溫度為65℃。
（1）.預雜交
在雜交瓶中加入雜交液（200px×8 cm的膜加5ml即可），將膜的背面貼緊雜交瓶壁，正面朝向雜交液。放入65℃雜交爐中，使雜交體系升到65℃。取經超聲粉碎的鮭魚精DNA（已溶解在水或TE中）100℃加熱變性5min，迅速加到雜交瓶中，使其濃度達到100μg/ml。過夜雜交。鮭魚精DNA的作用是封閉NC膜上沒有DNA轉移的位點，降低雜交背景、提高雜交特異性。
（2）．雜交
將變性的探針（95-100℃變性5min，冰浴5min）迅速加到雜交瓶中。65℃雜交過夜。
7、洗膜與檢測
取出NC膜，按照下列條件洗膜：
2×SSC/0.1% SDS，65℃，10min；
1×SSC/0.1% SDS，65℃，10min；中間5分鐘的時候檢測放射強度確定下一步時間。
0.5×SSC/0.1% SDS，65℃，10min；
在洗膜的過程中，不斷振搖，不斷用放射性檢測儀探測膜上的放射強度。實踐證明，當放射強度指示數值較環境背景高1-2倍時，是洗膜的終止點。上述洗膜過程無論在哪一步達到終點，都必須停止洗膜。洗完的膜用保鮮膜包裹，注意保鮮膜與NC膜之間不能有氣泡。將膜正面向上，放入暗盒中（加雙側增感屏），在暗室的紅光下，貼覆兩張X光片，每一片都用透明膠帶固定，合上暗盒，置-70℃低溫冰箱中曝光。根據信號強弱決定曝光時間，一般在1周左右。洗片時，先洗一張X光片，若感光偏弱，則再多加兩天曝光時間，再洗第二張片子。
影響Southern雜交實驗的因素很多，主要有：DNA純度、酶切效率、電泳分離效果、轉移效率、探針比活性和洗膜終止點等。
注意事項
（1）. 不可用手觸摸NC膜，否則影響DNA的轉移及與膜的結合。
（2）. 轉移時，凝膠的四周用Parafilm蠟膜封嚴，防止在轉移過程中產生短路，影響轉移效率，同時注意NC膜與凝膠及濾紙間不能留有氣泡，以免影響轉移。
（3）. 注意同位素的安全使用。