分子生物學產品常見問題分析 |
| 問題原因解決辦法DNA完全沒有被內切酶切割1) 內切酶失活標準底物檢測酶活性2) DNA不純，含有SDS，酚，EDTA等內切酶抑制因子將DNA過柱純化，乙醇沉淀DNA3) 條件不適（試劑、溫度）檢查反應系統是否最佳4) DNA酶切位點上的堿基被甲基化換用對DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新將質粒DNA轉化至dcm-，dam-基因型的細菌菌株5) DNA酶切位點上沒有甲基化（如Dpn I）換用不同切割非甲基化位點的同裂酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I)，重新將質粒轉至dcm+ dam+菌株中擴增6) DNA位點上存在其它修飾將DNA底物與λDAN混勻進行切割驗證7) DNA不存在該酶識別順序換用其它的酶切割DNA或過量酶消化進行驗證DNA切割不完全1) 內切酶活性下降用5-10倍量過量消化2) 內切酶稀釋不正確用酶貯藏液或反應緩沖液稀釋酶3) DNA不純，反應條件不佳同上4) 內切酶識別的DNA位點上的堿基被甲基化或存在其它修飾同上5) 部分DNA溶液粘在管壁上反應前離心數秒6) 內切酶溶液粘度大，取樣不準將內切酶稀釋，增大取樣體積7) 酶切后DNA粘末端退火電泳前將樣品置65℃保溫5-10分鐘，取出后置冰浴驟冷8) 由于反應溶液、溫度、強烈振蕩使內切酶變性使用標準反應緩沖液及溫度，避免強烈振蕩9) 過度稀釋使酶活性降低適當稀釋酶液，反應液稀釋的酶不能貯藏10)反應條件不適使用最佳反應體系11)識別位點兩側插入了可影響酶切效率的核酸順序加大酶量5-10倍DNA片段數目多于理倫值1) 內切酶星狀活性檢查反應條件：甘油濃度大于12%，鹽度過低，Mn2+的存在及酶：DNA值過大均均可導致星狀活性，降低酶的用量2) 其它內切酶污染用λDNA作底物檢查酶切結果3) 底物中含其它DNA雜質電泳檢查DNA，換用其它酶切，純化DNA片段酶切后沒有觀察到DNA片段的存在1) DNA定量錯誤（如RNA含量較高）用RNA酶A（無DNA酶）100ug/ml消化DNA樣，酚抽提后沉淀溶解，定量2) 在酶切反應液中形成非特異的沉淀在反應前透析DNA樣品或用酒精沉淀二次內切酶保存期內快速失活1) 保存溫度不合適內切酶貯藏在含50%甘油的貯藏液中，應在-20℃低溫保存2) 以稀釋形式保存稀釋酶液不宜長期存放，應一次使用3) 貯藏緩沖液不適當使用廠家推薦的貯藏緩沖液4) 低蛋白濃度內切酶與500ug/ml的BSA一起保存電泳后DNA片段的帶型彌散，不均一1) DNA上結合有蛋白質電泳前上樣液65℃加熱5min，并加入0.1%的SDS，酚/氯仿抽提純化2) 內切酶中含有DNA外切酶減少酶用量或消化時間，換用新包裝的酶酶切后的DNA片段連接效率低1) 含磷酸鹽的濃度高透析，乙醇沉淀去除磷酸鹽2) 內切酶失活不全或含有ATP酶延長滅活時間或用酚抽提，乙醇沉淀回收DNA3) 平末端連接加大T4 DNA Ligase用量4) 外切酶污染減少酶用量，縮短保溫時間，酚抽提回收DNA5) 連接緩沖液不合適重新配制連接緩沖液 三、DNA分子量標準問題分析： 問題原因解決辦法帶弱或無DNA帶1) 上樣DNA的量不夠增加DNA的上樣量，聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖電泳靈敏度稍高2) DNA降解避免DNA的核酸酶污染3) DNA走出凝膠減短電泳時間，降低電壓，增強凝膠濃度4) 對于EB染色的DNA，所用紫外光源不合適應用短波長（254nm），紫外燈增強靈敏度DNA帶缺失1) 小DNA帶走出凝膠減短電泳時間，降低電壓，增強凝膠濃度2) 分子大小相近的DNA帶不易分辨增加電泳時間，核準正確的凝膠濃度3) DNA 變性電泳前請勿高溫加熱DNA鏈，以20mM NaCl Buffer稀釋DNA4) 巨大DNA鏈，凝膠電泳不合適在脈沖電聲凝膠電泳上分析DNA帶模糊1) DNA降解避免核酸酶污染2) DNA上樣量過多減少凝膠中DNA上樣量3) 所用電泳條件不合適電泳時電壓不應超過20V/cm，溫度＜30℃,巨大DNA鏈，溫度應＜15℃，核查所用電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力4) DNA樣含鹽過高電泳前通過乙醇沉淀去除過多的鹽5) 有蛋白污染電泳前酚抽提去除蛋白6) DNA變性電泳前勿加熱，用20mM NaCl緩沖液稀釋DNA不規則DNA帶遷移1) 對于λ/Hind III片段COS位點復性電泳前加熱DNA 65℃加熱5-10分鐘，然后在冰上冷卻5分鐘2) 電泳條件不合適電泳電壓不超過20V/cm，溫度＜30℃，電泳緩沖液有足夠的緩沖能力3) DNA變性以20mM NaCl Buffer稀釋DNA，電泳前勿加熱 以λ/Hind III為代表的λDNA酶切片段用作電泳分析中的分子量標準，會發現電泳后分子量條帶不對的問題，解釋原因如下：在Lambda DNA分子的左右臂存在著12個堿基組成的具有互補順序的單鏈突出端-COS位點，COS位點的退火復性，在λDNA片段電泳分離時會出現問題，含左右臂片段在膠上應出現的地方條帶會減弱或完全看不到，而復性的左右臂片段會結合成大的片段，即在較大的分子量區域內產生一個額外的條帶，這就造成了不正常的帶型。解決以上問題的辦法，是在電泳之前，把DNA分子量標準67℃加熱約10分鐘，然后立即放入冰浴中驟冷，待樣品冷卻后上樣。這樣即可解離復性的粘性末端，使電泳過程DNA片段形成正常的帶型分布。 |