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  • 發布時間:2020-07-27 10:49 原文鏈接: 分子生物學實驗小技術

    當找到可能的重組質粒且條帶清晰時可直接切下含DNA 的凝膠條帶,用膠回收DNA 的方法回收質粒并進行酶切鑒定,如果DNA 量太少則需重提質粒。 用QIAprep Miniprep Spin 小量提質粒注意以下事項可提高得率

    A.用含抗生素的培養基培養細菌會有較高的得率。

    B.收菌時用tips吸干凈殘余的培養基上清。

    C.加入P1后應充分振蕩以完全打散懸浮細胞,特別是多次離心收菌的情況下較難打散細菌,可用tips 反復吸打因為殘留的小塊菌團會嚴重影響得率和DNA 的質量。

    D.加入P2后立即輕輕搖勻,可反復倒轉epperdorf 管4-6 次充分混勻菌數較多時可靜置不超過5 分鐘,以便充分裂解提高得率,超過5 分鐘的會降低質粒質量。甚至可能出現部分質粒不可逆的變性的情況,可能在電泳時得到一條酶切不動的質粒條帶。

    E.加入N3后立即輕輕混勻,可反復倒轉epperdorf 管5-7 次以充分混勻。菌數較多時可靜置幾分鐘以便質粒充分復性。

    F.離心后上清液上柱,注意不要將懸浮的細胞碎片(如果有的話)加入柱中,如已在柱中請吸出。我們建議一定用PB洗柱,特別是菌數較多,或菌株糖蛋白較多的情況,以保證DNA 的質量。

    G.對于較大的質粒,(<10Kb ),請70攝氏度預熱、洗脫buffer或ddH2O 以提高得率,對于拷貝數不高的情況可以用50ml洗脫buffer或ddH2O 分別洗2 次,如果拷貝數高的可用100ml.靜置1 分鐘后再離心,有助提高得率,buffer或H2O 應加在膜中央而非管壁上。




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