第三節從動物組織提取基因組DNA
一、材料
哺乳動物新鮮組織。
二、設備
移液管、高速冷凍離心機、臺式離心機、水浴鍋。
三、試劑
1、分離緩沖液：10mmol/L Tris?Cl pH7.4, 10mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA。
2、其它試劑：10% SDS，蛋白酶K (20mg/ml 或粉劑)，乙醚，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，無水乙醇及70%乙醇，5mol/L NaCl，3mol/L NaAc，TE。
四、操作步驟:
1. 切取組織5g 左右,剔除結締組織,吸水紙吸干血液,剪碎放入研缽(越細越好)。
2. 倒入液氮,磨成粉末,加10ml 分離緩沖液。
3. 加1ml 10% SDS, 混勻,此時樣品變得很粘稠。
4. 加50ul 或1mg 蛋白酶K, 37℃保溫1-2 小時, 直到組織完全解體。
5. 加1ml 5mol/L NaCl, 混勻,5000rpm 離心數秒鐘。
6.取上清液于新離心管，用等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提。待分層后,3000rpm 離心5 分 鐘。
7. 取上層水相至干凈離心管, 加2 倍體積乙醚抽提(在通風情況下操作)。
8. 移去上層乙醚,保留下層水相。
9. 加1/10 體積3mol/L NaAc, 及2 倍體積無水乙醇顛倒混合沉淀DNA。室溫下靜止10-20 分鐘，DNA 沉淀形成白色絮狀物。
10. 用玻棒鉤出DNA 沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水紙上吸干,溶解于1ml TE 中,-20℃保存。
11. 如果DNA 溶液中有不溶解顆粒,可在5000rpm 短暫離心,取上清; 如要除去其中的RNA,可加5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃保溫30 分鐘, 用酚抽提后, 按步驟9-10 重沉淀DNA。
第四節細菌基因組DNA 的制備
一、材料
細菌培養物。
二、設備
移液管, 高速冷凍離心機, 臺式離心機，水浴鍋。
三、試劑
1、CTAB/NaCl 溶液：4.1g NaCl 溶解于80ml H2 O,緩慢加入10g CTAB,加水至100ml。
2、其它試劑：氯仿:異戊醇(24:1)，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，異丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶K (20mg/ml 或粉劑)，5mol/L NaCl。
四、操作步驟：
1. 100ml 細菌過夜培養液, 5000rpm 離心10 分鐘, 去上清液。
2. 加9.5ml TE 懸浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50μl 20mg/ml(或1mg 干粉)蛋白酶K, 混勻,37℃保溫1 小時。
3. 加1.5ml 5mol/L NaCl, 混勻。
4. 加1.5ml CTAB/NaCl 溶液, 混勻, 65℃保溫20 分鐘。
5. 用等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm 離心10 分鐘, 將上清液移至干凈離心管。
6. 用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干凈管中。
7. 加1 倍體積異丙醇, 顛倒混合, 室溫下靜止10 分鐘，沉淀DNA。
8. 用玻棒撈出DNA 沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1ml TE, -20℃保存。如DNA 沉淀無法撈出,可5000rpm 離心, 使DNA 沉淀。
9. 如要除去其中的RNA, 可以按本章第三節中操作步驟處理。
第五節基因組DNA 的檢測
上述方法得到的DNA 一般可以用作Southern, RFLP、PCR 等分析。由于所用材料的不同,得到的DNA 產量及質量均不同,有時DNA 中含有酚類和多糖類物質,會影響酶切和PCR 的效果。所以獲得基因組DNA 后,均需檢測DNA 的產量和質量。
1. DNA 溶液稀釋20-30 倍后,測定OD260 /OD280 比值, 明確DNA 的含量和質量。
2. 取2-5μl 在0.7% agarose 膠上電泳, 檢測DNA 的分子大小。
3.
取2μg DNA, 用10 單位(U)HindⅢ酶切過夜, 0.7% agarose 膠上電泳, 檢測能否完全酶解(做RFLP, DNA
必須完全酶解)。如果DNA 中所含雜質多, 不能完全酶切, 或小分子DNA 多, 影響接續的分析和操作,可以用下列方法處理：
（1）選用幼嫩植物組織，可減少淀粉類的含量。
（2） 酚:氯仿抽提, 去除蛋白質和多糖。
（3）Sepharose 柱過濾, 去除酚類、多糖和小分子DNA。
（4）CsCl 梯度離心, 去除雜質, 分離大片段DNA(可用作文庫構建)。
思考題:
1. 為什么構建DNA 文庫時,一定要用大分子DNA？
2. 如何檢測和保證DNA 的質量？
第七章RFLP 和RAPD 技術
第一節概述
DNA
分子水平上的多態性檢測技術是進行基因組研究的基礎。RFLP(Restriction Fragment
LengthPolymorphism,限制片段長度多態性)已被廣泛用于基因組遺傳圖譜構建、基因定位以及生物進化和分類的研究。RFLP
是根據不同品種（個體）基因組的限制性內切酶的酶切位點堿基發生突變，或酶切位點之間發生了堿基的插入、缺失，導致酶切片段大小發生了變化，這種變化可以通過特定探針雜交進行檢測，從而可比較不同品種（個體）的DNA
水平的差異（即多態性），多個探針的比較可以確立生物的進化和分類關系。所用的探針為來源于同種或不同種基因組DNA
的克隆，位于染色體的不同位點，從而可以作為一種分子標記(Mark)，構建分子圖譜。當某個性狀（基因）與某個（些）分子標記協同分離時，表明這個性狀（基因）與分子標記連鎖。分子標記與性狀之間交換值的大小，即表示目標基因與分子標記之間的距離，從而可將基因定位于分子圖譜上。分子標記克隆在質粒上，可以繁殖及保存。不同限制性內切酶切割基因組DNA
后，所切的片段類型不一樣，因此，限制性內切酶與分子標記組成不同組合進行研究。常用的限制性內切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子標記則有幾個甚至上千個。分子標記越多，則所構建的圖譜就越飽和。構建飽和圖譜是RFLP研究的主要目標之一。運用隨機引物擴增尋找多態性DNA
片段可作為分子標記。這種方法即為RAPD(Random amplifiedpolymorphic DNA
，隨機擴增的多態性DNA)。盡管RAPD 技術誕生的時間很短, 但由于其獨特的檢測DNA
多態性的方式以及快速、簡便的特點,使這個技術已滲透于基因組研究的各個方面。該RAPD技術建立于PCR
技術基礎上,它是利用一系列(通常數百個)不同的隨機排列堿基順序的寡聚核苷酸單鏈(通常為10 聚體)為引物,對所研究基因組DNA 進行PCR
擴增.聚丙烯酰胺或瓊脂糖電泳分離,經EB染色或放射性自顯影來檢測擴增產物DNA片段的多態性,這些擴增產物DNA片段的多態性反映了基因組相應區域的DNA
多態性。RAPD 所用的一系列引物DNA 序列各不相同,但對于任一特異的引物,它同基因組DNA
序列有其特異的結合位點.這些特異的結合位點在基因組某些區域內的分布如符合PCR
擴增反應的條件,即引物在模板的兩條鏈上有互補位置,且引物3'端相距在一定的長度范圍之內,就可擴增出DNA
片段.因此如果基因組在這些區域發生DNA 片段插入、缺失或堿基突變就可能導致這些特定結合位點分布發生相應的變化,而使PCR
產物增加、缺少或發生分子量的改變。通過對PCR 產物檢測即可檢出基因組DNA
的多態性。分析時可用的引物數很大,雖然對每一個引物而言其檢測基因組DNA多態性的區域是有限的,但是利用一系列引物則可以使檢測區域幾乎覆蓋整個基因組。因此RAPD
可以對整個基因組DNA 進行多態性檢測。另外，RAPD 片段克隆后可作為RFLP 的分子標記進行作圖分析。本實驗將學習RFLP
的酶切,電泳和膜的制作以及RAPD 技術。探針標記及雜交檢測方法請另詳見分子雜交技術。