第五章重組質粒的連接、轉化及篩選
第一節概述
質粒具有穩定可靠和操作簡便的優點。如果要克隆較小的DNA
片段(＜10kb)且結構簡單,質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆,從原理上說是很簡單的，先用限制性內切酶切割質粒DNA
和目的DNA 片段, 然后體外使兩者相連接, 再用所得到重組質粒轉化細菌,即可完成。但在實際工作中, 如何區分插入有外源DNA
的重組質粒和無插入而自身環化的載體分子是較為困難的。通過調整連接反應中外源DNA片段和載體DNA的濃度比例,可以將載體的自身環化限制在一定程度之下,也可以進一步采取一些特殊的克隆策略,如載體去磷酸化等來最大限度的降低載體的自身環化,還可以利用遺傳學手段如α互補現象等來鑒別重組子和非重組子。外源DNA
片段和質粒載體的連接反應策略有以下幾種：
1、帶有非互補突出端的片段用兩種不同的限制性內切酶進行消化可以產生帶有非互補的粘性末端,這也是最容易克隆的DNA
片段，一般情況下,常用質粒載體均帶有多個不同限制酶的識別序列組成的多克隆位點，因而幾乎總能找到與外源DNA
片段末端匹配的限制酶切位點的載體，從而將外源片段定向地克隆到載體上。也可在PCR 擴增時，在DNA 片段兩端人為加上不同酶切位點以便與載體相連。
2、帶有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶處理可得到這樣的末端。由于質粒載體也必須用同一種酶消化，亦得到同樣的兩個相同粘性末端，因此在連接反應中外源片段和質粒載體DNA
均可能發生自身環化或幾個分子串連形成寡聚物, 而且正反兩種連接方向都可能有。所以，必須仔細調整連接反應中兩種DNA 的濃度,
以便使正確的連接產物的數量達到最高水平。還可將載體DNA 的5'磷酸基團用堿性磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制質粒DNA
的自身環化。帶5'端磷酸的外源DNA 片段可以有效地與去磷酸化的載體相連, 產生一個帶有兩個缺口的開環分子,在轉入E. coli
受體菌后的擴增過程中缺口可自動修復。
3、帶有平末端是由產生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產生，或由DNA
聚合酶補平所致。由于平端的連接效率比粘性末端要低得多，故在其連接反應中，T4 DNA 連接酶的濃度和外源DNA 及載體DNA
濃度均要高得多。通常還需加入低濃度的聚乙二醇(PEG 8000)以促進DNA 分子凝聚成聚集體的物質以提高轉化效率。特殊情況下，外源DNA
分子的末端與所用的載體末端無法相互匹配,則可以在線狀質粒載體末端或外源DNA
片段末端接上合適的接頭(linker)或銜接頭(adapter)使其匹配, 也可以有控制的使用E. coliDNA聚合酶Ⅰ的klenow
大片段部分填平3'凹端,使不相匹配的末端轉變為互補末端或轉為平末端后再進行連接。
本實驗所使用的載體質粒DNA為pBS,轉化受體菌為E.
coli DH5α菌株。由于pBS上帶有Ampr 和lacZ 基因,故重組子的篩選采用Amp 抗性篩選與α-互補現象篩選相結合的方法。因pBS
帶有Ampr 基因而外源片段上不帶該基因,故轉化受體菌后只有帶有pBS DNA 的轉化子才能在含有Amp 的LB
平板上存活下來;而只帶有自身環化的外源片段的轉化子則不能存活。此為初步的抗性篩選。pBS
上帶有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調控序列和β-半乳糖苷酶N 端146
個氨基酸的編碼序列。這個編碼區中插入了一個多克隆位點,但并沒有破壞lacZ 的閱讀框架,不影響其正常功能。E. coli
DH5α菌株帶有β-半乳糖苷酶C 端部分序列的編碼信息。在各自獨立的情況下,pBS 和DH5α編碼的β-半乳糖苷酶的片段都沒有酶活性。但在pBS
和DH5α融為一體時可形成具有酶活性的蛋白質。這種lacZ
基因上缺失近操縱基因區段的突變體與帶有完整的近操縱基因區段的β-半乳糖苷酸陰性突變體之間實現互補的現象叫α-互補。由α-互補產生的Lac+
細菌較易識別，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)誘導形成藍色菌落。當外源片段插入到pBS
質粒的多克隆位點上后會導致讀碼框架改變, 表達蛋白失活, 產生的氨基酸片段失去α-互補能力,
因此在同樣條件下含重組質粒的轉化子在生色誘導培養基上只能形成白色菌落。在麥康凱培養基上，α-互補產生的Lac+細菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麥康凱培養基中的乳糖，產生乳酸，使pH
下降，因而產生紅色菌落，而當外源片段插入后，失去α-互補能力，因而不產生β-半乳糖苷酶，無法分解培養基中的乳糖，菌落呈白色。由此可將重組質粒與自身環化的載體DNA
分開。此為α-互補現象篩選。
第二節材料、設備及試劑
一、材料
外源DNA 片段: 自行制備的帶限制性末端的DNA 溶液,濃度已知; 載體DNA: pBS 質粒(Ampr ,lacZ),自行提取純化,濃度已知; 宿主菌: E. coli DH5α,或JM 系列等具有α-互補能力的菌株。
二、設備
恒溫搖床，臺式高速離心機，恒溫水浴鍋， 瓊脂糖凝膠電泳裝置， 電熱恒溫培養箱，電泳儀無菌，工作臺， 微量移液槍，eppendorf 管。
三、試劑
1、連接反應緩沖液(10×)：0.5mol/L
Tris?Cl (pH7.6)，100mol/L MgCl2，100mol/L 二硫蘇糖醇(DTT)(過濾滅菌），500μg/ml
牛血清清蛋白(組分V.Sigma 產品）（可用可不用），10mol/L ATP（過濾滅菌）。
2、T4 DNA 連接酶(T4 DNA ligase)；購買成品。
3、X-gal 儲液(20mg/ml): 用二甲基甲酰胺溶解X-gal 配制成20mg/ml 的儲液, 包以鋁箔或黑紙以防止受光照被破壞, 儲存于-20℃。
4、IPTG 儲液(200mg/ml): 在800μl 蒸餾水中溶解200mg IPTG 后,用蒸餾水定容至1ml,用0.22μm 濾膜過濾除菌，分裝于eppendorf 管并儲于-20℃。
5、麥康凱選擇性培養基(Maconkey Agar)：取52g 麥康凱瓊脂加蒸餾水1000ml，微火煮沸至完全浴解，高壓滅菌，待冷至60℃左右加入Amp 儲存液使終濃度為50mg/ml，然后搖勻后涂板。
6、含X-gal 和IPTG 的篩選培養基：在事先制備好的含50μg/ml Amp 的LB 平板表面加40ml X-gal儲液和4μlIPTG 儲液,用無菌玻棒將溶液涂勻,置于37℃下放置3-4 小時,使培養基表面的液體完全被吸收。
7、感受態細胞制備試劑: 見第三章。
8、煮沸法快速分離質粒試劑: 見第一章。
9、質粒酶及電泳試劑: 見第二章。
第三節操作步驟
一、連接反應
1、取新的經滅菌處理的0.5ml eppendorf 管, 編號。
2、將0.1μg 載體DNA 轉移到無菌離心管中，加等摩爾量(可稍多)的外源DNA 片段。
3、加蒸餾水至體積為8μl,于45℃保溫5 分鐘,以使重新退火的粘端解鏈。將混和物冷卻至0℃。
4、加入10×T4 DNA ligase buffer 1μl, T4 DNA ligase 0.5μl, 混勻后用微量離心機將液體全部甩到管底,于16℃保溫8-24 小時。
同時做二組對照反應，其中對照組一只有質粒載體無外源DNA；對照組二只有外源DNA 片段沒有質粒載體。
二、E. coli DH5α感受態細胞的制備及轉化
每組連接反應混和物各取2μl 轉化E. coli DH5α感受態細胞。具體方法見第三章。
三、重組質粒的篩選
1、每組連接反應轉化原液取100μl 用無菌玻棒均勻涂布于篩選培養基上,37℃下培養半小時以上,直至液體被完全吸收。
2、倒置平板于37℃繼續培養12-16 小時,待出現明顯而又未相互重疊的單菌落時拿出平板。
3、放于4℃數小時,使顯色完全（此步麥康凱培養基不做）。不帶有pBS
質粒DNA 的細胞,由于無Amp 抗性,不能在含有Amp
的篩選培養基上成活。帶有pBS載體的轉化子由于具有β-半乳糖苷酶活性,在麥康凱篩選培養基上呈現為紅色菌落。在X-gal
和ITPG培養基上為藍色菌落。帶有重組質粒轉化子由于喪失了β-半乳糖苷酶活性,在麥康凱選擇性培養基和x-gal 和ITPG
培養基上均為白色菌落。
四、酶切鑒定重組質粒
用無菌牙簽挑取白色單菌落接種于含Amp 50μg/ml 的5ml
LB 液體培養基中,37℃下振蕩培養12 小時。使用煮沸法快速分離質粒DNA 直接電泳，同時以煮沸法抽提的pBS
質粒做對照，有插入片段的重組質粒電泳時遷移率較pBS 慢。再用與連接未端相對應的限制性內切酶進一步進行酶切檢驗。還可用雜交法篩選重組質粒。
[注意] 1、DNA 連接酶用量與DNA 片段的性質有關，連接平齊末端，必須加大酶量，一般使用連接粘性末端酶量的10-100 倍。
2、在連接帶有粘性末端的DNA 片段時，DNA 濃度一般為2-10mg/ml，在連接平齊末端時，需加入DNA 濃度至100-200mg/ml。
3、連接反應后，反應液在0℃儲存數天，-80℃儲存2 個月，但是在-20℃冰凍保存將會降低轉化效率。
4、粘性末端形成的氫鍵在低溫下更加穩定，所以盡管T4 DNA 連接酶的最適反應溫度為37℃，在連接粘性末端時，反應溫度以10-16℃為好，平齊末端則以15-20℃為好。
5、在連接反應中，如不對載體分子進行去5'磷酸基處理，便用過量的外源DNA 片段（2-5 倍），這將有助于減少載體的自身環化，增加外源DNA 和載體連接的機會。
6、麥康凱選擇性瓊脂組成的平板，在含有適當抗生素時，攜有載體DNA 的轉化子為淡紅色菌落，而攜有帶插入片段的重組質粒轉化子為白色菌落。該產品篩選效果同藍白斑篩選，且價格低廉。但需及時挑取白色菌落，當培養時間延長，白色菌落會逐漸變成微紅色，影響挑選。
7、X-gal
是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)以半乳糖苷酶（
b-galactosidase) 水解后生成的吲哚衍生物顯藍色。IPTG
是異丙基硫代半乳糖苷（Isopropylthiogalactoside)，為非生理性的誘導物，它可以誘導lacZ 的表達。
8、在含有X-gal 和IPTG 的篩選培養基上，攜帶載體DNA 的轉化子為藍色菌落，而攜帶插入片段的重組質粒轉化子為白色菌落，平板如在37℃培養后放于冰箱3-4 小時可使顯色反應充分，藍色菌落明顯。
思考題
1. 在用質粒載體進行外源DNA 片段克隆時主要應考慮哪些因素？
2. 利用α－互補現象篩選帶有插入片段的重組克隆的原理是什么？
第六章基因組DNA 的提取
第一節概述
基因組DNA
的提取通常用于構建基因組文庫、Southern 雜交(包括RFLP)及PCR
分離基因等。利用基因組DNA較長的特性,可以將其與細胞器或質粒等小分子DNA分離。加入一定量的異丙醇或乙醇，基因組的大分子DNA
即沉淀形成纖維狀絮團飄浮其中, 可用玻棒將其取出，而小分子DNA 則只形成顆粒狀沉淀附于壁上及底部,
從而達到提取的目的。在提取過程中,染色體會發生機械斷裂,產生大小不同的片段,因此分離基因組DNA
時應盡量在溫和的條件下操作,如盡量減少酚/氯仿抽提、混勻過程要輕緩, 以保證得到較長的DNA。一般來說,構建基因組文庫, 初始DNA
長度必須在100kb 以上,否則酶切后兩邊都帶合適末端的有效片段很少。而進行RFLP 和PCR 分析, DNA 長度可短至50kb,
在該長度以上,可保證酶切后產生RFLP 片段(20kb 以下),并可保證包含PCR 所擴增的片段(一般2kb
以下)。不同生物（植物、動物、微生物）的基因組DNA 的提取方法有所不同;
不同種類或同一種類的不同組織因其細胞結構及所含的成分不同，分離方法也有差異。在提取某種特殊組織的DNA 時必須參照文獻和經驗建立相應的提取方法,
以獲得可用的DNA 大分子。尤其是組織中的多糖和酶類物質對隨后的酶切、PCR 反應等有較強的抑制作用,因此用富含這類物質的材料提取基因組DNA
時, 應考慮除去多糖和酚類物質。本實驗以水稻幼苗(禾本科)、李(蘋果)葉子、動物肌肉組織和大腸桿菌培養物為材料,學習基因組DNA
提取的一般方法。
第二節從植物組織提取基因組DNA
一、材料
水稻幼苗或其它禾本科植物，李（蘋果）幼嫩葉子。
二、設備
移液器，冷凍高速離心機，臺式高速離心機，水浴鍋，陶瓷研缽，50ml 離心管（有蓋）及5ml
和1.5ml 離心管，彎成鉤狀的小玻棒。
三、試劑
1、提取緩沖液Ⅰ：100mmol/L Tris?Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。
2、提取緩沖液Ⅱ：18.6g 葡萄糖，6.9g 二乙基二硫代碳酸鈉，6.0gPVP，240ul 巰基乙醇，加水
至300ml。
3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇
4、RnaseA 母液：配方見第一章。
5、其它試劑：液氮、異丙醇、TE 緩沖液，無水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。
四、操作步驟：
（一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因組DNA 提取
1. 在50ml 離心管中加入20ml 提取緩沖液Ⅰ, 60℃水浴預熱。
2. 水稻幼苗或葉子5-10g, 剪碎, 在研缽中加液氮磨成粉狀后立即倒入預熱的離心管中, 劇烈搖動混勻, 60℃水浴保溫30-60 分鐘(時間長,DNA 產量高), 不時搖動。
3. 加入20ml 氯仿/戊醇/乙醇溶液, 顛倒混勻(需帶手套, 防止損傷皮膚)，室溫下靜置5-10 分鐘,使水相和有機相分層(必要時可重新混勻)。
4. 室溫下5000rpm 離心5 分鐘。
5. 仔細移取上清液至另一50ml 離心管,加入1 倍體積異丙醇,混勻,室溫下放置片刻即出現絮狀DNA 沉淀。
6. 在1.5ml eppendorf 中加入1ml TE。用鉤狀玻璃棒撈出DNA 絮團,在干凈吸水紙上吸干,轉入含TE 的離心管中,DNA 很快溶解于TE。
7. 如DNA 不形成絮狀沉淀,則可用5000rpm 離心5 分鐘, 再將沉淀移入TE 管中。這樣收集的沉淀,往往難溶解于TE,可在60℃水浴放置15 分鐘以上，以幫助溶解。
8. 將DNA 溶液3000rpm 離心5 分鐘, 上清液倒入干凈的5ml 離心管。
9. 加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃ 10 分鐘, 除去RNA(RNA 對DNA 的操作、分析一般無影響，可省略該步驟）。
10. 加入1/10 體積的3mol/L NaAc 及2×體積的冰乙醇,混勻,-20℃放置20 分鐘左右,DNA 形成絮狀沉淀。
11. 用玻棒撈出DNA 沉淀,70%乙醇漂洗,再在干凈吸水紙上吸干。
12. 將DNA 重溶解于1ml TE, -20 貯存。
13. 取2μl DNA 樣品在0.7% Agarose 膠上電泳, 檢測DNA 的分子大小。同時取15μl 稀釋20倍, 測定OD260/OD280, 檢測DNA 含量及質量。
[注意] 5g 樣品可保證獲得500μg DNA, 足供RFLP、PCR 等分析之用。
（二）. 從李(蘋果)葉子提取基因組DNA
1. 取3-5 克嫩葉, 液氮磨成粉狀。
2. 加入提取緩沖液Ⅱ10ml, 再研磨至溶漿狀。10000rpm, 10min。
3. 去上清液,沉淀加提取液Ⅰ20ml, 混勻。65℃, 30-60min, 常搖動。
4. 同本節（一）中步驟3-13 操作。