分子生物學常用實驗技術（十三）

2. 從RNA 合成單鏈cDNA 探針cDNA 單鏈探針主要用來分離cDNA 文庫中相應的基因。用RNA為模板合成cDNA 探針所用的引物有兩種: (1)用寡聚dT 為引物合成cDNA 探針。本方法只能用于帶Poly(A)的mRNA,并且產生的探針極大多數偏向于mRNA 3'末端序列。(2) 可用隨機引物合成cDNA探針。該法可避免上述缺點,產生比活性較高的探針。但由于模板RNA 中通常含有多種不同的RNA 分子,所得探針的序列往往比以克隆DNA 為模板所得的探針復雜得多, 應預先盡量富集mRNA 中的目的序列。反轉錄得到的產物RNA/DNA 雜交雙鏈經堿變性后,RNA 單鏈可被迅速地降解成小片段,經Sephadex G-50 柱層析即可得到單鏈探針。
材料：已提純的RNA 或mRNA
設備：高速臺式離心機，恒溫水浴鍋等。
試劑：
(1)合適的引物：隨機引物或oligo(dT)15-18。
(2)5mmol/L dGTP, dATP dCTP, dTTP。
(3) [a-32P]dCTP(>3000Ci/mmol, 10mCi/ml)。
(4)反轉錄酶(200000 單位/ml)。
(5)100mmol/L DTT。
250mmol/L MgCl2。
(7)1mol/L KCl。
0.5mol/L EDTA (pH8.0)。
(9)10% SDS。
(10)RNasin(40 單位/ml)。
操作步驟:
(1)在已置于冰浴中的滅菌離心管中加入下列試劑：
RNA 或mRNA 10.0ml
合適的產物(1mg/ml) 10.0ml
1mol/L Tris?Cl(pH7.6) 2.5ml
1mol/L KCl 3.5ml
250mmol/L MgCl2 2.0ml
5mmol/L dNTP 10.0ml
[a-32P]dCTP 10.0ml
0.1mol/L DTT 2.0ml
Rnasin 20U
加水至48ml
反轉錄酶(200000 單位/ml) 2ml
混勻后,稍稍離心，37℃保溫2 小時。
(2) 反應完畢后加入下列試劑： 0.5mol/L EDTA (pH8.0) 2ml 10% SDS 2ml
(3) 加入3ml 3mol/L NaOH。68℃保溫30 分鐘以水解RNA。
(4) 冷卻至室溫后, 加入10ml 1mol/L Tris?Cl (pH7.4)。混勻。然后加入3ml 2mol/L HCl。
(5) 酚/氯仿抽提后，用Sephadex G-50 柱層析或乙醇沉淀法分離標記的探針。[注意] RNA 極易降解，因而實驗中的所有試劑和器皿均應在DEPC 處理后，滅菌備用。

三、末端標記DNA 探針
現以Klenow 片段標記3'末端為例說明末端標記的方法。
1、材料：待標記的雙鏈含凹缺3'末端的DNA。
2、設備：高速臺式離心機，水浴鍋等。
3、試劑：
(1)3 種不含標記的dNTP 各為200mmol/L。
(2)合適的限制酶。
(3)[α-32P] dNTP:3000Ci/mmol, 10mCi/ul。
(4)Klenow 片段(5U/ml)。
(5)10×末端標記緩沖液:0.5mol/L Tris?Cl (pH7.2), 0.1mol/L MgSO4, 1mmol/L DTT, 500mg/mlBSA。
4、操作步驟：
(1)25μl 反應體系中用合適的限制酶酶切1μg 的DNA。
(2)按下列成分加入試劑并混勻： 已酶切的DNA 1mg (25ml) 10×末端標記緩沖液5ml 2mmol/L3 種dNTP 1ml [a-32P]-dNTP 適量加水至50ml
(3)加入1 單位的Klenow 片段,室溫下反應30 分鐘。
(4)加入1ml 2mmol/L 第四種核苷酸溶液, 室溫保溫15 分鐘。
(5)70℃加熱5 分鐘,終止反應。
用酚/氯仿抽提后,用乙醇沉淀來分離標記的DNA,或用Sephdadex G-50 柱層析分離標記的DNA。
[注意]
1、利用本方法可對DNA 分子量標準進行標記，利用它可定位因片段太小而無法在凝膠中觀察的DNA 片段。
2、對DNA 的純度不很嚴格，少量制備的質粒也可進行末端標記合成探針。
3、末端標記還有其他的一些方法，如利用T4 多核苷酸激酶標記脫磷的5'端突出的DNA 和平末端凹缺DNA 分子，也可利用該酶進行交換反應標記5'末端。

四、寡核苷酸探針
　　利用寡核苷酸探針可檢測到靶基因上單個核苷酸的點突變。常用的寡核苷酸探針主要有兩種:單一已知序列的寡核苷酸探針和許多簡并性寡核苷酸探針組成的寡核苷酸探針庫。單一已知序列寡核苷酸探針能與它們的目的序列準確配對,可以準確地設計雜交條件,以保證探針只與目的序列雜交而不與序列相近的非完全配對序列雜交,對于一些未知序列的目的片段則無效。
1、材料：待標記的寡核苷酸(10pmol/μl)。
2、設備：高速離式離心機，恒溫水浴鍋等。
3、試劑：
(1)10×T4 多核苷酸激酶緩沖液:0.5mol/L Tris?Cl (pH7.6), 0.1mol/L MgCl2 , 50mmol/L DTT,
1mmol/L Spermidine?HCl, 1mmol/L EDTA (pH8.0)。
(2)[γ-32 P] ATP(比活性7000Ci/mmol; 10mCi/ml)。
(3)T4 多核苷酸激酶（10 單位/ml）。
4、操作步驟：
(1)100ng 寡核苷酸溶于30ml 水中。置65℃變性5 分鐘，迅速置冰溶中。
(2)立即加入下列試劑：
10×激酶緩沖液5ml
[g-32P]ATP(比活性7000Ci/mmol;10mCi/ml) 10ml
T4 多核苷酸激酶2ml
加水至50ml
混勻后置37℃水浴20 分鐘。
(3)再加入20 單位T4 多核苷酸激酶，置37℃水浴20 分鐘后立即置冰浴中。
(4)Sephadex G-50 柱層析。

　　此方法是在每個探針的5'末端多加了一個磷酸，理論上，這會影響其與DNA 的雜交。因此，建議使用Klenow DNA 聚合酶的鏈延伸法獲得高放射性的寡核苷酸探針。除了常見的同位素標記探針外，還有利用非同位素標記探針和雜交的方法，許多公司都有不同的非同位素標記探針的雜交系統出售，可根據這些公司所提供的操作步驟進行探針的標記和雜交。

五、RNA 探針
　　許多載體如pBluescript, pGEM 等均帶有來自噬菌體SP6 或E.coli 噬菌體T7 或T3 的啟動子,它們能特異性地被各自噬菌體編碼的依賴于DNA 的RNA 聚合酶所識別,合成特異性的RNA。在反應體系中若加入經標記的NTP，則可合成RNA 探針。RNA 探針一般都是單鏈,它具有單鏈DNA 探針的優點,又具有許多DNA 單鏈探針所沒有的優點，主要是： RNA NA 雜交體比DNA NA 雜交體有更高的穩定性,所以在雜交應中RNA 探針比相同比活性的DNA 探針所產生信號要強。RNA:RNA 雜交體用RNA 酶A 酶切比S1 酶切DNA:RNA 雜交體容易控制,所以用RNA 探針進行RNA 結構分析比用DNA 探針效果好。噬菌體依賴DNA 的RNA 聚合酶所需的rNTP 濃度比Klenow 片段所需的dNTP 濃度低,因而能在
較低濃度放射性底物的存在下,合成高比活性的全長探針。用來合成RNA 的模板能轉錄許多次,所以RNA 的產量比單鏈DNA 高。并且用來合成RNA 的模板能轉錄多次，可獲得比單鏈DNA 更高產量的RNA。

　　反應完畢后，用無RNA 酶的DNA 酶Ⅰ處理,即可除去模板DNA,而單鏈DNA 探針則需通過凝膠電泳純化才能與模板DNA 分離。另外噬菌體依賴于DNA 的RNA 聚合酶不識別克隆DNA 序列中的細菌、質粒或真核生物的啟動子，對模板的要求也不高,故在異常位點起始RNA 合成的比率很低。因此,當將線性質粒和相應的依賴DNA 的RNA 聚合酶及四種rNTP 一起保溫時,所有RNA 的合成,都由這些噬菌體啟動子起始。而在單鏈DNA 探針合成中,若模板中混雜其他DNA 片段,則會產生干擾。但它也存在著不可避免的缺點，因為合成的探針是RNA，它對RNase 特別敏感，應而所用的器皿試劑等均應仔細地去除RNase；另外如果載體沒有很好地酶切則等量的超螺旋DNA 會合成極長的RNA，它有可能帶上質粒的序列而降低特異性。

第二節幾種常見的雜交
　　分子雜交是通過各種方法將核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性標記的探針與被固定的分子雜交，經顯影后顯示出目的DNA 或RNA 分子所處的位置。根據被測定的對象，分子雜交基本可分為以下幾大類：
(1) Southern 雜交NA 片段經電泳分離后,從凝膠中轉移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上,然后與探針雜交。被檢對象為DNA,探針為DNA 或RNA。
(2) Northern 雜交:RNA 片段經電泳后,從凝膠中轉移到硝酸纖維素濾膜上,然后用探針雜交。被檢對象為RNA,探針為DNA 或RNA。根據雜交所用的方法,另外還有斑點(dot)雜交、狹槽(slot)雜交和菌落原位雜交等。有3 種固相支持體可用于雜交:硝酸纖維素濾膜、尼龍膜和Whatman 541 濾紙。不同商標的尼龍膜需要進行不同的處理，在DNA 固定和雜交的過程中要嚴格按生產廠家的說明書來進行。Whatman 541 濾紙有很高的濕強度,最早用于篩選細菌菌落。該濾紙主要用于篩選一些基因文庫。固定化DNA 的雜交條件基本與使用硝酸纖維素濾膜時所建立的條件相同。Whatman 541 濾紙與硝酸纖維素濾膜相比有一些優點:它更便宜,雜交中更耐用,干燥過程中不易變形和碎裂等。然而若變性過程不小心,雜交信號的強度會明顯弱于用硝酸纖維素濾膜時所得到的信號強度。因此,常規的細菌篩選和各種雜交時仍選用硝酸纖維素濾膜作為固相支持體。

一、Southern 雜交
　　Southern 雜交可用來檢測經限制性內切酶切割后的DNA片段中是否存在與探針同源的序列,它包括下列步驟:
(1) 酶切DNA, 凝膠電泳分離各酶切片段,然后使DNA 原位變性。
(2) 將DNA 片段轉移到固體支持物(硝酸纖維素濾膜或尼龍膜)上。
(3) 預雜交濾膜,掩蓋濾膜上非特異性位點。
(4) 讓探針與同源DNA 片段雜交,然后漂洗除去非特異性結合的探針。
(5) 通過顯影檢查目的DNA 所在的位置。
　　 Southern 雜交能否檢出雜交信號取決于很多因素,包括目的DNA 在總DNA 中所占的比例、探針的大小和比活性、轉移到濾膜上的DNA 量以及探針與目的DNA 間的配對情況等。在最佳條件下,放射自顯影曝光數天后, Southern 雜交能很靈敏地檢測出低于0.1pg 與32 P 標記的高比活性探針的(>109cpm/μg)互補DNA。如果將10μg 基因組DNA 轉移到濾膜上，并與長度為幾百個核苷酸的探針雜交,曝光過夜,則可檢測出哺乳動物基因組中1kb 大小的單拷貝序列。將DNA 從凝膠中轉移到固體支持物上的方法主要有3 種1)毛細管轉移。本方法由Southern 發明,故又稱為Southern 轉移(或印跡)。毛細管轉移方法的優點是簡單,不需要用其他儀器。缺點是轉移時間較長,轉移后雜交信號較弱。(2)電泳轉移。將DNA 變性后,可電泳轉移至帶電荷的尼龍膜上。該法的優點是不需要脫嘌呤/水解作用,可直接轉移較大的DNA 片段。缺點是轉移中電流較大,溫度難以控制。通常只有當毛細管轉移和真空轉移無效時,才采用電泳轉移。(3) 真空轉移。有多種真空轉移的商品化儀器,它們一般是將硝酸纖維素膜或尼龍膜放在真空室上面的多孔屏上,再將凝膠置于濾膜上,緩沖液從上面的一個貯液槽中流下,洗脫出凝膠中的DNA,使其沉積在濾膜上。該法的優點是快速,在30 分鐘內就能從正常厚度(4-5mm)和正常瓊脂糖濃度(<1%)的凝膠中量地轉移出來。轉移后得到的雜交信號比Southern 轉移強2-3 倍。缺點是如不小心，會使凝膠碎裂, 并且在洗膜不嚴格時,其背景比毛細轉移要高。

1、材料： 待檢測的DNA，已標記好的探針。
2、設備： 電泳儀，電泳槽，塑料盆，真空烤箱，放射自顯影盒，X-光片，雜交袋，硝酸纖維素濾膜或尼龍膜，濾紙。
3、試劑：
(1)10mg/ml 溴化乙錠（EB）。
(2)50×Denhardt's 溶液：5g Ficoll-40, 5g PVP, 5g BSA 加水至500ml,過濾除菌后于-20℃儲存。
(3)1×BLOTTO:5g 脫脂奶粉，0.02%疊氮鈉，儲于4℃。
(4)預雜交溶液:6×SSC, 5×Denhardt, 0.5% SDS, 100mg/ml 鮭魚精子DNA, 50%甲酰胺。
(5)雜交溶液:預雜交溶液中加入變性探針即為雜交溶液。
0.2mol/L HCl。
(7)0.1% SDS。
0.4mol/L NaOH。
(9)變性溶液:87.75g NaCl, 20.0g NaOH 加水至1000ml。
(10)中和溶液:175.5g NaCl, 6.7g Tris?Cl, 加水至1000ml。
(11)硝酸纖維素濾膜。
(12)20×SSC: 3mol/L NaCl, 0.3mol/L 檸檬酸鈉,用1mol/L HCl 調節pH 至7.0;
(13)2×、1×、0.5×、0.25×和0.1×SSC:用20×SSC 稀釋。
4、操作步驟：
(1) 約50μl 體積中酶切10pg-10μg 的DNA, 然后在瓊脂糖凝膠中電泳12-24 小時(包括DNA分子量標準物)。
(2) 500ml 水中加入25μl 10mg/ml 溴化乙錠,將凝膠放置其中染色30 分鐘, 然后照相。
(3) 依次用下列溶液處理凝膠,并輕微搖動: 500ml 0.2mol/L HCl 10 分鐘, 傾去溶液(如果限制性片段>10kb, 酸處理時間為20 分鐘)，用水清洗數次,傾去溶液; 500ml 變性溶液兩次,每次15 分鐘,傾去溶液; 500ml 中和溶液30 分鐘。如果使用尼龍膜雜交，本步可以省略。
(4) 戴上手套,在盤中加20×SSC 液,將硝酸纖維素濾膜先用無菌水完全濕透,再用20×SSC 浸泡。將硝酸纖維素濾膜一次準確地蓋在凝膠上,去除氣泡。用浸過20×SSC 液的3 濾紙蓋住濾膜,然后加上干的3 濾紙和干紙巾,根據DNA 復雜程度轉移2-12 小時。當使用尼龍膜雜交時，該膜用水浸潤一次即可，轉移時用0.4mol/L NaOH 代替20×SSC。簡單的印跡轉移2-3 小時,對于基因組印跡,一般需要較長時間的轉移。
(5) 去除紙巾等,用藍色圓珠筆在濾膜右上角記下轉移日期,做好記號,取出濾膜,在2×SSC 中洗5分鐘,涼干后在80℃中烘烤2 小時。注意在使用尼龍膜雜交時，只能空氣干燥，不得烘烤。將濾膜放入含6-10ml 預雜交液的密封小塑料袋中,將預雜交液加在袋的底部,前后擠壓小袋,使濾膜濕透。在一定溫度下(一般為37-42℃)預雜交3-12 小時，棄去預雜交液。
(7) 制備同位素標記探針（參見第一節），探針煮沸變性5 分鐘。在雜交液中加入探針,混勻。如步驟（6）將混合液注入密封塑料袋中,在與預雜交相同溫度下雜交6-12 小時。
(9) 取出濾膜,依次用下列溶液處理,并輕輕搖動: 在室溫下, 1×SSC/0.1% SDS, 15 分鐘, 兩次。在雜交溫度下, 0.25×SSC/0.1% SDS, 15 分鐘, 兩次。
(10) 空氣干燥硝酸纖維素濾膜,然后在X 光片上曝光。通常曝光1-2 天后可見DNA 譜帶。對于≥108 cpm/μg 從缺口平移所得探針,可很容易地從10μg 哺乳DNA 中檢測到10pg 的單拷貝基因。

二、Northern 雜交
　　Northern 雜交與Southern 雜交很相似。主要區別是被檢測對象為RNA,其電泳在變性條件下進行,以去除RNA 中的二級結構,保證RNA 完全按分子大小分離。變性電泳主要有3 種:乙二醛變性電泳、甲醛變性電泳和羥甲基汞變性電泳。電泳后的瓊脂糖凝膠用與Southern 轉移相同的方法將RNA 轉移到硝酸纖維素濾膜上,然后與探針雜交。
1、材料：待檢測的RNA 及制備好的探針。
2、設備：電泳儀，電泳槽，塑料盆，真空烤箱，放射自顯影盒，X-光片，雜交袋，硝酸纖維素膜或尼龍膜。
3、試劑：
(1)20×SSPE:175.3g NaCl, 88.2g 檸檬酸鈉，溶于800ml 水中，用10mol/LNaOH 調pH 至7.4，定溶到1L。
(2)其他試劑：與Southern 雜交試劑類似，只是所有的試劑均應用DEPC 處理。
4、操作步驟：
(1)RNA 經變性電泳完畢后,可立即將乙醛酰RNA 轉移至硝酸纖維素濾膜上。轉移方法與轉移DNA的方法相似。
(2)轉移完畢后,以6×SSC 溶液于室溫浸泡此膜5 分鐘,以除去瓊脂糖碎片。
(3)將該雜交膜夾于兩張濾紙中間,用真空烤箱于80℃干燥0.5-2 小時。
(4) 用下列兩種溶液之一進行預雜交，時間為1-2 小時。若于42℃進行,應采用: 50%甲酰胺，5×SSPE，2×Denhardt's 試劑，0.1% SDS；若于68℃進行,應采用:6×SSC，2×Denhardt's 試劑，0.1%SDS，（注意：BLOTTO 不能用于Northern 雜交）。
(5) 在預雜交液中加入變性的放射性標記探針,如欲檢測低豐度mRNA,所用探針的量至少為0.1μg,其放射性比活度應大于2×108 cpm/分?μg,放在適宜的溫度條件下雜交16-24 小時。用1×SSC、0.1% SDS 于室溫洗膜20 分鐘,隨后用0.2×SSC、0.1% SDS 于68℃洗膜3 次,每次20 分鐘。
(7) 用X 光片(Kodak XAR-2 或與之相當的產品)進行放射自顯影,附加增感屏于-70℃曝光24-48小時。
[注意]
(1)如果瓊脂糖濃度高于1%，或凝膠厚度大于0.5cm，或待分析的RNA 大于2.5kb,需用0.05mol/LNaOH 浸泡凝膠20 分鐘,部分水解RNA 并提高轉移效率。浸泡后用經DEPC 處理的水淋洗凝膠,并用20×SSC 浸泡凝膠45 分鐘。然后再轉移到濾膜上。
(2)在步驟(3)的操作中，如果濾膜上含有乙醛酰RNA,雜交前需用20mmol/L Tris?Cl (pH8.0)于65℃洗膜,以除去RNA 上的乙二醛分子。
(3)RNA 自凝膠轉移至尼龍膜所用方法，與RNA 轉移至硝酸纖維素濾膜所用方法類似。
(4)含甲醛的凝膠在RNA 轉移前需用經DEPC 處理的水淋洗數次,以除去甲醛。當使用尼龍膜雜交時注意，有些帶正電荷的尼龍膜在堿性溶液中具有固著核酸的能力，需用7.5mmol/LNaOH 溶液洗脫瓊脂糖中的乙醛酰RNA，同時可部分水解RNA，并提高較長RNA 分子(>2.3kb)轉移的速度和效率。
　　 此外，堿可以除去mRNA 分子的乙二醛加合物,免去固定后洗脫的步驟。乙醛酰RNA 在堿性條件下轉移至帶正電荷尼龍膜的操作也按DNA 轉移的方法進行，但轉移緩沖液為7.5mmol/LNaOH，轉移結束后(4.5-6.0 小時)，尼龍膜需用2×SSC、0.1%SDS 淋洗片刻、于室溫晾干。
(5)尼龍膜的不足之處是背景較高,用RNA 探針時尤為嚴重。將濾膜長時間置于高濃度的堿性溶液中,會導致雜交背景明顯升高,可通過提高預雜交和雜交步驟中有關阻斷試劑的量來予以解決。如用中性緩沖液進行RNA 轉移,轉移結束后,將晾干的尼龍膜夾在兩張濾紙中間,80℃干烤0.5-2 小時,或者254nm 波長的紫外線照射尼龍膜帶RNA 的一面。后一種方法較為繁瑣,但卻優先使用,因為某些批號的帶正電荷的尼龍膜經此處理后,雜交信號可以增強。然而為獲得最佳效果,務必確保尼龍膜不被過度照射，適度照射可促進RNA 上小部分堿基與尼龍膜表面帶正電荷的胺基形成交聯結構,而過度照射卻使RNA 上一部分胸腺嘧啶共價結合于尼龍膜表面,導致雜交信號減弱。