五、操作步驟：
（一）、模板制備
1、M13 單鏈模板制備：在轉化入合適的大腸桿菌宿主菌且在含有指示劑如X-gal/IPTG
的培養基上鋪板之后, 含有M13
重組子的細胞將表現出無色的"噬菌斑"，事實上受感染的細胞并非被噬菌體溶菌或殺死，出現噬菌斑是因為被感染的細菌在生長速度上比其周圍未感染的細菌慢的緣故,
從無色噬菌斑上得到的感染細胞經培養便能產生測序反應所需的單鏈模板。
（1）過夜培養的宿主細胞(如NM522 或JM101)用3ml TYP 肉汁培養基以1:100 稀釋。在37℃強烈震蕩1 小時之后, 細胞進入對數早期。此時, 將一個合適的含有重組M13 的噬菌斑(連同瓊脂)用滴管轉入該細胞培養液中。
（2）37℃強烈震蕩(300rpm) 培養6 小時。
（3）把細胞培養液轉入兩只1.5ml eppendorf 管, 12000g 離心15 分鐘。上清液轉移到新的eppendorf 管再離心15 分鐘。小心地取出1-1.2ml 上清液(注意不能觸及沉淀), 再轉到新的eppendorf管。.
（4）將0.25
體積的含20％PEG(-8000)的3.75M 醋酸銨(pH7.5)加入上清液以沉淀噬菌體。混勻后置冰上30 分鐘, 再以12000g
離心15 分鐘, 傾去上清液, 再以同樣方法離心一次, 用吸液器尖頭將殘留的PEG 充分吸干凈。此時應能見管底有芝麻大小的噬菌體顆粒沉淀。
（5）將沉淀物重溶于400ml TE 緩沖液中。
（6）加等體積氯仿/異戊醇(24:1)混合液, 強烈震蕩1 分鐘，12000g 離心5 分鐘。
（7）將水相轉入一新的eppendorf 管, 注意不能觸動原管中兩相交界面。加等體積苯酚/氯仿(1:1)混合液, 強烈振蕩1 分鐘, 12000g 離心5 分鐘。
（8）將上層水相轉入另一新的eppendorf 管, 重復第7 步的提取, 如有必要重復多次直至二相之間無可見物質存在。
（9）將上層水相轉入一新的eppendorf 管, 加等體積氯仿, 強烈振蕩1 分鐘后, 12000g 離心5分鐘, 多次重復此步驟。
（10）將上層水相轉入新的eppendorf 管, 加0.5 倍體積的7.5 mol/L 醋酸銨, 2 倍體積乙醇, 混勻后-20℃放置30 分鐘。
（11）12000g 離心15 分鐘, 去除上清液, 用70％乙醇小心清洗沉淀, 如果沉淀已被攪起, 重新離心, 傾去酒精, 真空干燥沉淀物。
（12）將DNA 的沉淀物溶解于20ml 去離子水中，取2ml 樣品進行瓊脂糖凝膠電泳定量, 如果DNA 量充足, 則可進行退火測序。
2、噬粒(Phagemid)單鏈模板的制備：
噬粒是指含有絲狀單鏈DNA 噬菌體復制區的嵌合質粒。分子克隆中常用的pBluescript 系列和pGEM系列的質粒均屬噬粒。含重組噬粒的細胞單菌落經液體培養并用輔助噬菌體超感染后就能產生測序反應所需的單鏈DNA 模板。
（1）從新鮮平板上挑得含pGEM 質粒DNA 的抗Amp 單菌落, 并接種到100ml 含有50mg/ml氨芐的TYP 肉湯培養基中, 在37℃振蕩過夜。
（2）取100ml 過夜培養物接種到另一新的裝有5ml 含50mg/mlAmp 的TYP 肉汁培養基的試管中, 在37℃強烈振蕩30 分鐘。
（3）加40μl 輔助噬菌體R408 或M13 K07, 繼續劇烈攪拌振蕩培養6-8 小時，使輔助噬菌體超感染。
（4）12000g 離心15 分鐘后，去除沉淀，取上清，轉移到一新eppendorf 管中再次離心15分鐘, 小心地取1-1.2ml 上清液(注意不能觸及沉淀)。
（5）將0.25
體積的含20％ PEG-的3.75M 醋酸銨加入上清液以沉淀噬菌體顆粒。混勻后置冰上30 分鐘, 再以12000g 離心15 分鐘,
傾去上清液, 再以同樣方法離心一次, 用移液器尖頭將殘留的PEG 溶液吸凈。此時應能看到管底有芝麻大小的噬菌體顆粒沉淀。
（6）將沉淀物溶解于400ml TE 緩沖液(10mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA)。
（7）加等體積氯仿/異戊醇(24:1)混合液, 強烈振蕩1 分鐘, 再以12000g 離心5 分鐘。
（8）將水相轉入一干凈eppendorf 管(不要觸動原管中兩相交界面), 加等體積酚/氯仿(1:1)混合液, 強烈振蕩1 分鐘, 12000g 離心5 分鐘。
（9）上層水相轉入一干凈eppendorf 管重復第8 步驟提取, 如有必要重復多次直至二相之間無可見物質。
（10）將上層水相轉入一干凈eppendorf 管加等體積氯仿, 強烈振蕩1 分鐘后離心, 多次重復此步驟。
（11）將上層水相轉入一干凈eppendorf 管加0.5 倍體積7.5mol/L pH7.5 醋酸銨, 再加2 倍體積乙醇, 混和后-20℃放置30 分鐘。
（12）12000g 離心15 分鐘, 去除上清液, 用70％乙醇小心清洗沉淀, 如沉淀已被攪起,重新離心, 傾去乙醇, 真空干燥沉淀。
（13）將沉淀物溶解于20ml 去離子水中, 取2ml 樣品進行瓊脂糖凝膠電泳進行定量，如果DNA量充足，則進行退火和測序。
3、質粒膜板制備：參照第一章所述的方法。
（二）超螺旋質粒DNA 的堿變性：
1、取4mg（約2pmol）超螺旋質粒DNA 至一eppendorf 管中，加無離子水到終體積18ml。
2、加2ml 2mmol/L NaOH/2mmol/L EDTA 溶液, 置于室溫(25℃下）保溫5 分鐘。
3、加2ml 2mol/L NaAc 溶液(pH4.6)渦旋混勻，使之中和。
4、加75ml 無水乙醇，充分混勻后，置于干冰或-70℃沉淀10 分鐘。
5、于12000g 離心10 分鐘，棄去上清，用200ml 預冷的70%乙醇洗沉淀后，干燥沉淀，溶于20ml 無離子水中。
（三）、測序反應：
1、引物和模板的退火：
（1）在一離心管中，混合如下幾種試劑：引物約1-2pmol
5×T7 DNA 聚合酶測序反應緩沖液2ml
DNA 約1mg
加ddH2O 終體積至10ml 。
（2）將試管蓋蓋上后，65℃
加熱2 分鐘，然后在大約30
分鐘左右的時間內，使試管的溫度緩慢地降到室溫。降溫的過程中可使用小的加熱板或小型的保溫儀，也可使用已調至65℃的水浴，使它們的溫度在室溫下緩慢地降至室溫即可。當溫度降至30℃以下時，退火結束。可將小試管置于冰上，退火完畢的模板須在4
小時內使用。
2、標記反應
（1）在一個標準的反應過程中（從引物處開始，可讀到500 個堿基以上），首先需要按1:5
稀釋標記混合物。如4ml 混合物則加雙蒸無離子水16ml。該稀釋液儲存在-20℃可使用數周。如果所要測定的序列小于30
個堿基，可將標記緩沖液稀釋15 倍，同時，模板DNA
要高于0.5pmol。由于DNA模板量的不足，會降低標記反應的程度，即只標記引物后的幾個核苷酸。
（2）用冰預冷的TE 緩沖液按1:8 稀釋T7 DNA 聚合酶。酶液稀釋后應立即使用，置于冰浴不宜超過60 分鐘。不得使用標記混合物、DTT 溶液或非緩沖液類溶液稀釋酶液。
（3）在已退火的引物-模板混合物中，依次加入：
0.1mol/L DTT 1.0ml
標記混合物2.0ml
[a-35P]dATP 或[a-35S]dATP 0.5ml
已稀釋好的T7 DNA 聚合酶2.0ml
混合充分（注意不得產生氣泡），置于室溫5-10 分鐘。
如果在電泳時碰到帶壓縮問題，則dITP 混合物的效果優于dGTP 混合物，dITP 混合物的使用方
法與dGTP 混合物的使用是相似的。
[注意] 1、稀釋時應將所有的溶液預先混合完全后再加入酶液。
2、在第（3）步的過程中，如果反應中有幾次冷卻，保溫的時間過長或溫度太高的話，則會使測序反應短于100 個堿基。
3、鏈終止反應：
（1）取4 支eppendorf 管分別標上G，A，T，C。
（2）每個管分別加入2.5ml G，A，T，C 鏈末端終止混合物，立即蓋上蓋子以防液體蒸發（本反應最好在標記反應前做好）。dGTP 和dITP 混合物依據各自需要選用。
（3）將eppendorf 管預熱至37℃ 1 分鐘。
（4）待標記反應完畢后，取3.5ml 標記反應液至上述4 支eppendorf 管中，稍微離心一下，并將上述四管置于37℃保溫。注意在每一次反應中，均應使用新的吸液頭，以免交叉污染。
（5）繼續保溫3-5 分鐘（若使用dITP 時，保溫時間可延長至30 分鐘，對反應產物沒有任何影響。
（6）在上述四管中各加入4ml 終止緩沖液。混合均勻后，置于冰浴中。本樣品即可上樣電泳。用35S 標記反應的樣品可置于-20℃保存一周，此時樣品只有極少量的降解。而32P 標記的則需在當天電泳以免降解。
（四）測序凝膠板的制備及電泳參考第一節測序凝膠板的制備及電泳部分。樣品加熱至75-80℃ 2 分鐘，立即上樣，每個泳道的使用量為2-3ml
（五）測序凝膠板的干燥及放射自顯影。
電泳完畢后，經32P 或35S 標記的產物可用對b-射線敏感的X-光膠片放射自顯影檢測。
1、取下電泳的玻璃板，去除兩邊的壓條，用小的薄鋼片撬開玻璃板。若玻璃板用粘合硅烷處理過，凝膠會緊緊地粘合于玻璃板上，則凝膠與玻璃板一起進行下面步驟的處理。如果玻璃板沒有經過粘合硅烷的處理，則可用3MM
大濾紙貼在有凝膠的玻璃板上，小心地揭下凝膠，準備下一步的處理。
2、去除尿素，將含有凝膠的玻璃板或濾紙浸于含有2 升10%冰醋酸的大號顯液盆中，輕輕振蕩15 分鐘，去除尿素。
3、干膠：含有凝膠的玻璃板可用電吹風吹干，而含有凝膠的濾紙則可用專用的干膠設備如真空加熱干膠儀抽干。
4、已經干燥的凝膠即可進行放射自顯影。在玻璃板含有凝膠的這一面加上X-光片后，用另一塊相似大小的玻璃板夾住，然后用夾子固定，置于暗盒中曝光。而含有凝膠的濾紙則可置于X-光曝光盒中放射自顯影。一般32P 曝光過夜即可，而35S 為2-3 天。
5、曝光完畢后的X-光片即可沖洗，獲得序列信息。將X 光片置于水中先濕潤，然后置于顯影液中顯影，直至條帶清晰顯示為止。X-光片用水淋洗片刻后置于定影液中定影15 分鐘以上。取出X-光片干燥并讀出序列。
[
注意] 1、去除尿素是非常重要的，如果有殘存的尿素，則在干膠過程中會使凝膠很粘，而無法進行放射自顯影。可以用10%冰醋酸洗二次，第一次15
分鐘，第二次10
分鐘。如果膠濃度高于12%，則有可能在干膠過程中會產生皺紋，防止的方法有二種：（1）冰醋酸溶液中加入1%-2%的甘油；（2）不干燥膠，直接在冰箱中以冰凍狀態曝光，應注意的是在使用這個方法時，要在凝膠和X-光片之間加一層薄的塑料薄膜。一般來說都使用第一種方法。
2、凝膠一定要充分干燥方可進行曝光，否則X-光片會粘在膠的表面，致使以后的操作困難。
3、曝光時間應根據所使用的同位素而定，如果同位素已過半衰期則應相應延長曝光的時間。