分子生物學常用實驗技術（page1)

第一章質粒DNA 的分離、純化和鑒定
第二章DNA 酶切及凝膠電泳
第三章大腸桿菌感受態細胞的制備和轉化
第四章RNA 的提取和cDNA 合成
第五章重組質粒的連接、轉化及篩選
第六章基因組DNA 的提取
第七章RFLP 和RAPD 技術
第八章聚合酶鏈式反應(PCR)擴增和擴增產物克隆
第九章分子雜交技術
第十章測序技術

第一章質粒DNA 的分離、純化和鑒定

第一節概述

　　 把一個有用的目的DNA片段通過重組DNA技術,送進受體細胞中去進行繁殖和表達的工具叫載體(Vector)。細菌質粒是重組DNA 技術中常用的載體。

　　質粒(Plasmid)是一種染色體外的穩定遺傳因子,大小從1-200kb 不等,為雙鏈、閉環的DNA 分子,并以超螺旋狀態存在于宿主細胞中。質粒主要發現于細菌、放線菌和真菌細胞中，它具有自主復制和轉錄能力,能在子代細胞中保持恒定的拷貝數,并表達所攜帶的遺傳信息。質粒的復制和轉錄要依賴于宿主細胞編碼的某些酶和蛋白質，如離開宿主細胞則不能存活,而宿主即使沒有它們也可以正常存活。質粒的存在使宿主具有一些額外的特性,如對抗生素的抗性等。F 質粒(又稱F 因子或性質粒)、R 質粒(抗藥性因子)和Col 質粒(產大腸桿菌素因子)等都是常見的天然質粒。

　　質粒在細胞內的復制一般有兩種類型:緊密控制型(Stringent control)和松馳控制型(Relaxedcontrol)。前者只在細胞周期的一定階段進行復制,當染色體不復制時,它也不能復制,通常每個細胞內只含有1 個或幾個質粒分子,如F 因子。后者的質粒在整個細胞周期中隨時可以復制,在每個細胞中有許多拷貝,一般在20 個以上,如Col E1 質粒。在使用蛋白質合成抑制劑-氯霉素時,細胞內蛋白質合成、染色體DNA 復制和細胞分裂均受到抑制,緊密型質粒復制停止,而松馳型質粒繼續復制,質粒拷貝數可由原來20 多個擴增至1000-3000 個,此時質粒DNA 占總DNA 的含量可由原來的2%增加至40-50%。

　　利用同一復制系統的不同質粒不能在同一宿主細胞中共同存在,當兩種質粒同時導入同一細胞時,它們在復制及隨后分配到子細胞的過程中彼此競爭,在一些細胞中,一種質粒占優勢,而在另一些細胞中另一種質粒卻占上風。當細胞生長幾代后,占少數的質粒將會丟失,因而在細胞后代中只有兩種質粒的一種，這種現象稱質粒的不相容性(Incompatibility)。但利用不同復制系統的質粒則可以穩定地共存于同一宿主細胞中。

　　質粒通常含有編碼某些酶的基因,其表型包括對抗生素的抗性,產生某些抗生素,降解復雜有機物,產生大腸桿菌素和腸毒素及某些限制性內切酶與修飾酶等。

　　質粒載體是在天然質粒的基礎上為適應實驗室操作而進行人工構建的。與天然質粒相比,質粒載體通常帶有一個或一個以上的選擇性標記基因(如抗生素抗性基因)和一個人工合成的含有多個限制性內切酶識別位點的多克隆位點序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量盡可能減少,以便于基因工程操作。大多質粒載體帶有一些多用途的輔助序列,這些用途包括通過組織化學方法肉眼鑒定重組克隆、產生用于序列測定的單鏈DNA、體外轉錄外源DNA 序列、鑒定片段的插入方向、外源基因的大量表達等。一個理想的克隆載體大致應有下列一些特性：（1）分子量小、多拷貝、松馳控制型；（2）具有多種常用的限制性內切酶的單切點；（3）能插入較大的外源DNA 片段；（4）具有容易操作的檢測表型。常用的質粒載體大小一般在1kb 至10kb 之間，如PBR322、PUC 系列、PGEM 系列和pBluescript（簡稱pBS）等。

　　從細菌中分離質粒DNA 的方法都包括3 個基本步驟:培養細菌使質粒擴增；收集和裂解細胞;分離和純化質粒DNA。采用溶菌酶可以破壞菌體細胞壁,十二烷基磺酸鈉(SDS)和Triton X-100 可使細胞膜裂解。經溶菌酶和SDS 或Triton X-100 處理后,細菌染色體DNA 會纏繞附著在細胞碎片上,同時由于細菌染色體DNA 比質粒大得多,易受機械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。當用強熱或酸、堿處理時，細菌的線性染色體DNA 變性,而共價閉合環狀DNA(Covalently closed circularDNA，簡稱cccDNA)的兩條鏈不會相互分開，當外界條件恢復正常時，線狀染色體DNA 片段難以復性,而是與變性的蛋白質和細胞碎片纏繞在一起,而質粒DNA 雙鏈又恢復原狀,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解狀態存在于液相中。

　　在細菌細胞內,共價閉環質粒以超螺旋形式存在。在提取質粒過程中，除了超螺旋DNA 外，還會產生其它形式的質粒DNA。如果質粒DNA 兩條鏈中有一條鏈發生一處或多處斷裂,分子就能旋轉而消除鏈的張力,形成松馳型的環狀分子,稱開環DNA(Open circular DNA, 簡稱ocDNA)；如果質粒DNA 的兩條鏈在同一處斷裂,則形成線狀DNA(Linear DNA)。當提取的質粒DNA 電泳時,同一質粒DNA 其超螺旋形式的泳動速度要比開環和線狀分子的泳動速度快。

　　第二節材料、設備及試劑

　　一、材料
　　含pBS 的E. coli DH5α或JM 系列菌株，1.5ml 塑料離心管(又稱eppendorf 管),離心管架。

　　二、設備
　　微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 臺式高速離心機，恒溫振蕩搖床， 高壓蒸汽消毒器(滅菌鍋)， 渦旋振蕩器， 電泳儀，瓊脂糖平板電泳裝置和恒溫水浴鍋等。

　　三、試劑
1、LB 液體培養基(Luria-Bertani) ：稱取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g，溶于800ml 去離子水中，用NaOH 調pH 至7.5, 加去離子水至總體積1 升,高壓下蒸氣滅菌20 分鐘。

2、LB 固體培養基：液體培養基中每升加12g 瓊脂粉,高壓滅菌。

3、氨芐青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成50mg/ml 水溶液, -20℃保存備用。

4、溶菌酶溶液： 用10mmol/L Tris?Cl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml,并分裝成小份(如1.5ml)保存于-20℃,每一小份一經使用后便予丟棄。

5、3mol/l NaAc (pH5.2)： 50ml 水中溶解40.81g NaAc?3H2 O,用冰醋酸調pH 至5.2, 加水定容至100ml, 分裝后高壓滅菌,儲存于4℃冰箱。

6、溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L EDTA (pH8.0)。溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高壓滅菌15 分鐘,儲存于4℃冰箱。

7、溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH (臨用前用10mol/L NaOH 母液稀釋)，1％ SDS。

8、溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸11.5ml， H2O 28.5ml，定容至100ml, 并高壓滅菌。溶液終濃度為: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L。

9、RNA 酶A 母液：將RNA 酶A 溶于10mmol/L Tris?Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl 中,配成10mg/ml的溶液,于100℃加熱15 分鐘,使混有的DNA 酶失活。冷卻后用1.5ml eppendorf 管分裝成小份保存于-20℃。

10、飽和酚：市售酚中含有醌等氧化物,這些產物可引起磷酸二酯鍵的斷裂及導致RNA 和DNA的交聯,應在160℃用冷凝管進行重蒸。重蒸酚加入0.1％的8-羥基喹啉(作為抗氧化劑),并用等體積的0.5mol/L Tris?Cl (pH8.0)和0.1mol/L Tris?Cl(pH8.0)緩沖液反復抽提使之飽和并使其pH 值達到7.6以上,因為酸性條件下DNA 會分配于有機相。

11、氯仿:按氯仿:異戊醇＝24:1 體積比加入異戊醇。氯仿可使蛋白變性并有助于液相與有機相的分開,異戊醇則可起消除抽提過程中出現的泡沫。按體積/體積＝1:1 混合上述飽和酚與氯仿即得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿均有很強的腐蝕性，操作時應戴手套。

12、TE 緩沖液：10 mmo/L Tris?Cl (pH8.0)，1 mmol/L EDTA (pH8.0)。高壓滅菌后儲存于4℃冰箱中。

13、STET：0.1 mol/L NaCl，10mmol/L Tris?Cl(pH8.0)，10 mmol/L EDTA (pH8.0)， 5% TritonX-100。

14、STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris?Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)。

15、電泳所用試劑： （1） TBE 緩沖液(5×)：稱取Tris 54g，硼酸27.5g，并加入0.5M EDTA(pH8.0) 20ml，定溶至1000ml。（2）上樣緩沖液(6×)：0.25% 溴酚藍，40% (w/v) 蔗糖水溶液。

　　第三節操作步驟

　　一、細菌的培養和收集
　　將含有質粒pBS 的DH5α菌種接種在LB 固體培養基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培養12-24 小時。用無菌牙簽挑取單菌落接種到5ml LB 液體培養基(含50μg/ml Amp)中,37℃振蕩培養約12 小時至對數生長后期。

　　二、質粒DNA 少量快速提取
　　質粒DNA 小量提取法對于從大量轉化子中制備少量部分純化的質粒DNA 十分有用。這些方法共同特點是簡便、快速，能同時處理大量試樣,所得DNA 有一定純度,可滿足限制酶切割、電泳分析的需要。

（一）、煮沸法
1、將1.5ml 培養液倒入eppendorf 管中,4℃下12000ｇ離心30 秒。
2、棄上清，將管倒置于衛生紙上幾分鐘，使液體流盡。
3、將菌體沉淀懸浮于120ml STET 溶液中, 渦旋混勻。
4、加入10ml 新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 渦旋振蕩3 秒鐘。
5、將eppendorf 管放入沸水浴中,50 秒后立即取出。
6、用微量離心機4℃下12000g 離心10 分鐘。
7、用無菌牙簽從eppendorf 管中去除細菌碎片。
8、取20ml 進行電泳檢查。
[注意] 1. 對大腸桿菌可從固體培養基上挑取單個菌落直接進行煮沸法提取質粒DNA。
　　　2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,濃度高時,細菌裂解效果反而不好。有時不同溶菌酶也能溶菌。
　　　3. 提取的質粒DNA 中會含有RNA,但RNA 并不干擾進一步實驗,如限制性內切酶消化,亞克隆及連接反應等。

（二）、堿法
1、取1.5ml 培養液倒入1.5ml eppendorf 管中,4℃下12000g 離心30 秒。
2、棄上清,將管倒置于衛生紙上數分鐘,使液體流盡。
3、菌體沉淀重懸浮于100μl 溶液Ⅰ中(需劇烈振蕩),室溫下放置5-10 分鐘。
4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf 管數次,以混勻內容物(千萬不要振蕩),冰浴5 分鐘。
5、加入150μl 預冷的溶液Ⅲ,蓋緊管口，并倒置離心管，溫和振蕩10 秒,使沉淀混勻,冰浴中5-10分鐘,4℃下12000g 離心5-10 分鐘。
6、上清液移入干凈eppendorf 管中,加入等體積的酚/氯仿(1:1),振蕩混勻,4℃下12000g 離心5分鐘。
7、將水相移入干凈eppendorf 管中,加入2 倍體積的無水乙醇,振蕩混勻后置于-20℃冰箱中20分鐘，然后4℃下12000g 離心10 分鐘。
8、棄上清,將管口敞開倒置于衛生紙上使所有液體流出,加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g 離心5-10 分鐘。
9、吸除上清液,將管倒置于衛生紙上使液體流盡,真空干燥10 分鐘或室溫干燥。
10、將沉淀溶于20μl TE 緩沖液(pH8.0，含20μg /ml RNaseA)中，儲于-20℃冰箱中。
[注意] 1. 提取過程應盡量保持低溫。
　　　2. 提取質粒DNA 過程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果較單獨用酚或氯仿好,要將蛋白盡量除干凈需多次抽提。
　　　3. 沉淀DNA 通常使用冰乙醇,在低溫條件下放置時間稍長可使DNA 沉淀完全。沉淀DNA 也可用異丙醇(一般使用等體積),且沉淀完全,速度快,但常把鹽沉淀下來,所以多數還是用乙醇。

（三）、Wizard 少量DNA 純化系統
　　Promega 公司的Wizard 少量DNA 純化系統可快速有效的抽提質粒DNA,整個過程只需15 分鐘。提取的質粒可直接用于DNA 測序、酶切分析和體外轉錄等。

　　該系統中所含試劑和柱子可以用于50 次1-3ml 質粒培養液的分離和純化，試劑包括10ml 細胞懸浮液，10ml 細胞裂解液；10ml 中和液，50ml Wizard 少量DNA 純化樹脂，50ml 柱洗液（使用前加95%乙醇至120ml )和50 支Wizard 微型柱。

1、1-3ml 過夜培養細胞液4℃下12000g 離心1-2 分鐘。
2、去除上清液，菌體細胞懸浮于200μl 細胞懸浮液中,充分混合,并移入eppendorf 管中。
3、加200μl 細胞裂解液, 顛倒離心管數次,直到溶液變清亮。
4、加200μl 中和液,顛倒離心管數次。
5、4℃下12000g 離心5 分鐘，取上清液于新的eppendorf 管中。
6、加1ml Wizard 少量DNA 純化樹脂,顛倒離心管數次以充分混勻。
7、取一次性注射器, 取出注塞,并使注射筒與Wizard 微型柱連接,用移液槍將上述混合液加入注射筒中,并用注塞輕推,使混合物進入微型柱。
8、將注射器與微型柱分開,取出注塞, 再將注射筒與微型柱相連,加入2ml 柱洗液,并用注塞輕推，使柱洗液進入微型柱。
9、取出微型柱置于eppendorf 管中,離心2 分鐘以除去微型柱中的柱洗液。
10、將微型柱放在一個新eppendorf 管中，加50μl TE(或水)于微型柱中，靜止1 分鐘后，4℃下12000g 離心20 秒。
11、丟棄微型柱，將eppendorf 管中的質粒DNA 貯于4℃或-20℃冰箱。
[注意] 樹脂使用前應充分混勻,如有結晶,可將樹脂用25-37℃水浴處理10 分鐘。

　　三、質粒DNA 的大量提取和純化

　　在制作酶譜、測定序列、制備探針等實驗中需要高純度、高濃度的質粒DNA,為此需要大量提取質粒DNA。大量提取的質粒DNA 一般需進一步純化,常用柱層析法和氯化絕梯度離心法。

（一）、堿法
1、取培養至對數生長后期的含pBS 質粒的細菌培養液250ml，4℃下5000g 離心15 分鐘,棄上清,將離心管倒置使上清液全部流盡。
2、將細菌沉淀重新懸浮于50ml 用冰預冷的STE 中（此步可省略）。
3、同步驟1 方法離心以收集細菌細胞。
4、將細菌沉淀物重新懸浮于5ml 溶液I 中,充分懸浮菌體細胞。
5、加入12ml 新配制的溶液II, 蓋緊瓶蓋,緩緩地顛倒離心管數次,以充分混勻內容物,冰浴10 分鐘。
6、加9ml 用冰預冷的溶液III, 搖動離心管數次以混勻內容物,冰上放置15 分鐘,此時應形成白色絮狀沉淀。
7、4℃下5000g 離心15 分鐘。
8、取上清液,加入50ml RNA 酶A(10mg/ml), 37℃水浴20 分鐘。
9、加入等體積的飽和酚/氯仿,振蕩混勻,4℃下12000g 離心10 分鐘。
10、取上層水相, 加入等體積氯仿,振蕩混勻,4℃下12000g 離心10 分鐘。
11、取上層水相,加入1/5 體積的4mol/L NaCl 和10% PEG(分子量6000), 冰上放置60 分鐘。
12、4℃下12000g 離心15 分鐘, 沉淀用數ml 70%冰冷乙醇洗滌，4℃下12000g 離心5 分鐘。
13、真空抽干沉淀，溶于500ml TE 或水中。
[注意] 1. 提取過程中應盡量保持低溫。
　　　2. 加入溶液II 和溶液III 后操作應混和,切忌劇烈振蕩。
　　　3. 由于RNA 酶A 中常存在有DNA 酶,利用RNA 酶耐熱的特性,使用時應先對該酶液進行熱處理(80℃ 1 小時),使DNA 酶失活。

（二）、Wazard 大量DNA 純化系統
　　堿法大量提取DNA 往往需要很長的時間.Promega 公司的Wiazrd 大量DNA 純化系統既簡單又快速,只需要離心和真空抽干,這個系統可以從500ml 培養液中在3 小時以內獲得1mg 以上的高質量的質粒DNA(200-20000bp)。該系統不需要酚和氯仿抽提,純化后的DNA 溶于水或TE 緩沖液中，不含任何鹽份，可以直接用于DNA 序列分析和酶切反應，也可以用于在核酸酶抑制劑（如RNasin）存在的條件下進行體外轉錄反應等。

　　該系統中含有的試劑和柱子可以用于10 次100-500ml 質粒培養液的分離和純化,試劑包括: 150ml 細胞懸浮液，150ml 細胞裂解液，150ml 中和液，100ml Wizard 大量DNA 純化樹脂，125ml Wizard柱子洗脫溶液和10 支Wizard 帶有存儲離心管的柱子。

1、100-500ml 細胞培養液置離心管中, 22-25℃下5000g 離心10 分鐘, 所得細胞沉淀充分懸浮于細胞懸浮液中。
2、加15ml 細胞裂解溶液并輕輕混合,可以反復倒置混合,但不能用渦旋振蕩,細胞裂解完全時,溶液會變清,這一步需要20 分鐘。
3、加15ml 中和溶液,立即反復倒置離心管數次，并使之混勻。
4、14000g,22-25℃離心15 分鐘。
5、小心地將上清液吸出并移至一個新離心管中。
6、加0.5 倍體積的異丙醇,混合均勻, 14000g 22-25℃下離心15 分鐘。
7、棄上清,懸浮DNA 沉淀于2ml TE 緩沖液中。這一步中也許有的沉淀不能溶解。
8、加10ml Wizard 大量DNA 純化樹脂溶液, 并渦旋混合。
9、每一個樣品,使用一支Wizard 大量柱子,柱子的頭插在真空器上(Promega 產品,與此配套)。
10、將樹脂/DNA 混合液轉入柱子中,真空抽取樹脂/DNA 混合液。
11、將樹脂/DNA 混合液抽干后,加13ml 柱子洗脫溶液至離心管中, 對管底部的樹脂/DNA 進行洗脫(柱子一邊旋轉一邊加入洗脫液)，并加入柱子中。
12、真空抽干所加入的洗脫。
13、再加12ml 柱子洗脫液進柱子并抽干。
14、加入5ml 80％乙醇漂洗柱中的樹脂, 柱子真空抽干后將柱子放入用戶提供的離心管中,2500rpm(1300g)離心5 分鐘。
15、取出柱子，真空抽干5 分鐘,再將柱子放入系統中所提供的離心管中，2500rpm(1300g)離心5 分鐘。
16、在柱子中加入1.5ml 65-70℃預熱過的滅菌重蒸水或TE,1 分鐘后2500rpm(1300g)離心柱子/離心管5 分鐘。
17、取出柱子,離心管中溶液即為提取的質粒DNA,可以直接放在離心管中,蓋上蓋子，儲存在4℃或-20℃備用。
[注意] 1. 在使用之前,系統所提供的柱子洗脫液按1:1 加入125ml 95％乙醇。
　　　2. 純化樹脂必須混勻后再用.

（三）、Sephrose 2B 柱純化質粒DNA
　　堿法提取的質粒DNA 即使用RNA 酶處理,仍會含有少量RNA。當有些試驗需無RNA 污染的DNA制品時,則需進行進一步純化。一般常用Sepharose 2B 或Sepharose 4B 進行純化,該方法具有快速,條件溫和,重復性好,載體物質可以再利用等優點,因而已廣泛用于質粒DNA 純化。

1、將Sepharose 2B 經含0.1% SDS 的TE（pH8.0）平衡后上柱。
2、將至多1ml 的DNA 溶液鋪在Sepharase 2B 柱上。
3、待DNA 溶液完全進入柱內后立即在柱的上部連接含有0.1% SDS 的TE(pH8.0)貯液瓶。
4、以1ml 流出液為1 份進行收集。
5、對每一管測定其OD260 值,以確定哪些管中含有質粒DNA。通常質粒DNA 在柱上流出的第一個峰中。
6、合并所有含質粒的洗脫液,用等體積的酚/氯仿(1:1)抽提,4℃下12000g 離心2 分鐘,將上層水相轉入新管。
7、加入2 倍體積的冰冷無水乙醇，-20℃下沉淀10 分鐘,然后4℃下12000g 離心10 分鐘,棄去上清液。
8、沉淀加70%乙醇洗滌,4℃下12000g 離心10 分鐘,棄去上清液。
9、沉淀真空抽干,重新溶于TE 或無菌水中。
[注意] 在裝柱過程中,要防止柱床中出現斷裂或氣泡現象,要使界面保持平整。對新裝成的柱,應用含0.1% SDS 的TE 平衡, 以使柱內的凝膠均勻。

思考題
1. 質粒的基本性質有哪些？
2. 質粒載體與天然質粒相比有哪些改進？
3. 在堿法提取質粒DNA 操作過程中應注意哪些問題？

第二章DNA 酶切及凝膠電泳

第一節概述

一. DNA 的限制性內切酶酶切分析
　　限制性內切酶能特異地結合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA 序列之內或其附近的特異位點上,并切割雙鏈DNA。它可分為三類:Ⅰ類和Ⅲ類酶在同一蛋白質分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴于ATP 的存在。Ⅰ類酶結合于識別位點并隨機的切割識別位點不遠處的DNA，而Ⅲ類酶在識別位點上切割DNA 分子,然后從底物上解離。Ⅱ類由兩種酶組成: 一種為限制性內切核酸酶(限制酶),它切割某一特異的核苷酸序列; 另一種為獨立的甲基化酶,它修飾同一識別序列。Ⅱ類中的限制性內切酶在分子克隆中得到了廣泛應用，它們是重組DNA 的基礎。絕大多數Ⅱ類限制酶識別長度為4 至6個核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列(如EcoRⅠ識別六個核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少數酶識別更長的序列或簡并序列。Ⅱ類酶切割位點在識別序列中,有的在對稱軸處切割,產生平末端的DNA 片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位點在對稱軸一側,產生帶有單鏈突出末端的DNA 片段稱粘性未端, 如EcoRⅠ切割識別序列后產生兩個互補的粘性末端。

5'.G↓AATTC.3' →5'. G AATTC.3'
3'.CTTAA↑G .5' →3'. CTTAA G.5'

　　DNA 純度、緩沖液、溫度條件及限制性內切酶本身都會影響限制性內切酶的活性。大部分限制性內切酶不受RNA 或單鏈DNA 的影響。當微量的污染物進入限制性內切酶貯存液中時,會影響其進一步使用,因此在吸取限制性內切酶時,每次都要用新的吸管頭。如果采用兩種限制性內切酶,必須要注意分別提供各自的最適鹽濃度。若兩者可用同一緩沖液,則可同時水解。若需要不同的鹽濃度,則低鹽濃度
的限制性內切酶必須首先使用,隨后調節鹽濃度,再用高鹽濃度的限制性內切酶水解。也可在第一個酶切反應完成后，用等體積酚/氯仿抽提，加0.1 倍體積3mol/L NaAc 和2 倍體積無水乙醇，混勻后置-70℃低溫冰箱30 分鐘，離心、干燥并重新溶于緩沖液后進行第二個酶切反應。

　　DNA 限制性內切酶酶切圖譜又稱DNA 的物理圖譜，它由一系列位置確定的多種限制性內切酶酶切位點組成，以直線或環狀圖式表示。在DNA 序列分析、基因組的功能圖譜繪制、DNA 的無性繁殖、基因文庫的構建等工作中，建立限制性內切酶圖譜都是不可缺少的環節，近年來發展起來的RFLP(限制性片段長度多態性)技術更是建立在它的基礎上。

　　構建DNA 限制性內切酶圖譜有許多方法。通常結合使用多種限制性內切酶，通過綜合分析多種酶單切及不同組合的多種酶同時切所得到的限制性片段大小來確定各種酶的酶切位點及其相對位置。酶切圖譜的使用價值依賴于它的準確性和精確程度。

　　在酶切圖譜制作過程中，為了獲得條帶清晰的電泳圖譜，一般DNA 用量約為0.5-1μg。限制性內切酶的酶解反應最適條件各不相同,各種酶有其相應的酶切緩沖液和最適反應溫度(大多數為37℃)。對質粒DNA 酶切反應而言, 限制性內切酶用量可按標準體系1μg DNA 加1 單位酶,消化1-2 小時。但要完全酶解則必須增加酶的用量,一般增加2-3 倍,甚至更多,反應時間也要適當延長。

二. 凝膠電泳
　　瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳是分離鑒定和純化DNA 片段的標準方法。該技術操作簡便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度離心法）所無法分離的DNA 片段。當用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, E 染色,在紫外光下至少可以檢出1-10ng 的DNA條帶,從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外,還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA 條帶,用于以后的克隆操作。

　　瓊脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各種形狀、大小和孔隙度。瓊脂糖凝膠分離DNA 片度大小范圍較廣,不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度從200bp 至近50kb 的DNA 片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強度和方向恒定的電場下電泳。聚丙烯酰胺分離小片段DNA(5-500bp)效果較好,其分辯力極高,甚至相差1bp 的DNA 片段就能分開。聚丙烯酰胺凝膠電泳很快,可容納相對大量的DNA,但制備和操作比瓊脂糖凝膠困難。聚丙烯酰胺凝膠采用垂直裝置進行電泳。目前,一般實驗室多用瓊脂糖水平平板凝膠電泳裝置進行DNA 電泳。

　　瓊脂糖主要在DNA 制備電泳中作為一種固體支持基質,其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場中,在中性pH 值下帶負電荷的DNA 向陽極遷移,其遷移速率由下列多種因素決定:
1、DNA 的分子大小:
　　線狀雙鏈DNA 分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA 分子量對數成反比，分子越大則再所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。
2、瓊脂糖濃度
　　一個給定大小的線狀DNA 分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA 電泳遷移率的對數與凝膠濃度成線性關系。凝膠濃度的選擇取決于DNA 分子的大小。分離小于0.5kb 的DNA片段所需膠濃度是1.2-1.5%,分離大于10kb 的DNA 分子所需膠濃度為0.3-0.7%, DNA 片段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。
3、DNA 分子的構象
　　當DNA 分子處于不同構象時,它在電場中移動距離不僅和分子量有關,還和它本身構象有關。相同分子量的線狀、開環和超螺旋DNA 在瓊脂糖凝膠中移動速度是不一樣的,超螺旋DNA 移動最快,而線狀雙鏈DNA 移動最慢。如在電泳鑒定質粒純度時發現凝膠上有數條DNA 帶難以確定是質粒DNA 不同構象引起還是因為含有其他DNA 引起時,可從瓊脂糖凝膠上將DNA 帶逐個回收,用同一種限制性內切酶分別水解,然后電泳,如在凝膠上出現相同的DNA 圖譜,則為同一種DNA。
4、電源電壓
　　在低電壓時,線狀DNA 片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強度的增加，不同分子量的DNA 片段的遷移率將以不同的幅度增長,片段越大,因場強升高引起的遷移率升高幅度也越大,因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb 的DNA 片段的分辨率達到最大,所加電壓不得超過5v/cm。
5、嵌入染料的存在
　　熒光染料溴化乙啶用于檢測瓊脂糖凝膠中的DNA,染料會嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環狀DNA，使其剛性更強,還會使線狀DNA 遷移率降低15％。
6、離子強度影響
　　電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA 的電泳遷移率。在沒有離子存在時(如誤用蒸餾水配制凝膠),電導率最小,DNA 幾乎不移動,在高離子強度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液),則電導很高并明顯產熱,嚴重時會引起凝膠熔化或DNA 變性。

　　對于天然的雙鏈DNA,常用的幾種電泳緩沖液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成濃縮母液,儲于室溫。

第二節材料、設備及試劑

一、材料
　　λDNA: 購買或自行提取純化; 重組pBS 質料或pUC19 質粒; EcoRI 酶及其酶切緩沖液: 購買成品; HindⅢ酶及其酶切緩沖液: 購買成品;瓊脂糖(Agarose): 進口或國產的電泳用瓊脂糖均可。

二、設備
　　水平式電泳裝置,電泳儀,臺式高速離心機, 恒溫水浴鍋, 微量移液槍, 微波爐或電爐,紫外透射儀,照相支架, 照相機及其附件。

三、試劑
　　1、5×TBE 電泳緩沖液：配方見第一章。
　　2、6×電泳載樣緩沖液：0.25％ 溴粉藍，40％(w/v) 蔗糖水溶液，貯存于4℃。
　　3、溴化乙錠(E 溶液母液:將EB 配制成10mg/ml,用鋁箔或黑紙包裹容器,儲于室溫即可。

第三節操作步驟

一、DNA 酶切反應
　　1、將清潔干燥并經滅菌的eppendorf 管(最好0.5ml)編號,用微量移液槍分別加入DNA 1μg 和相應的限制性內切酶反應10×緩沖液2μl,再加入重蒸水使總體積為19μl,將管內溶液混勻后加入1μl 酶液,用手指輕彈管壁使溶液混勻,也可用微量離心機甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整個實驗成敗的關鍵,要防止錯加，漏加。使用限制性內切酶時應盡量減少其離開冰箱的時間，以免活性降低。
　　2、混勻反應體系后,將eppendorf 管置于適當的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保溫2-3 小時,使酶切反應完全。
　　3、每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混勻,以停止反應,置于冰箱中保存備用。

二、DNA 分子量標準的制備
　　采用EcoRⅠ或HindⅢ酶解所得的λDNA 片段來作為電泳時的分子量標準。λDNA 為長度約50kb的雙鏈DNA 分子,其商品溶液濃度為0.5mg/ml,酶解反應操作如上述。HindIII 切割DNA 后得到8 個片段,長度分別為23.1, 9.4, 6.6, 4.4, 2.3, 2.0, 0.56 和0.12kb。EcoRI 切割lDNA 后得到6 個片段,長度分別為21.2, 7.4, 5.8, 5.6, 4.9 和2.5kb。

三、瓊脂糖凝膠的制備
　　1、取5×TBE 緩沖液20ml 加水至200ml,配制成0.5×TBE 稀釋緩沖液,待用。
　　2、膠液的制備：稱取0.4g 瓊脂糖,置于200ml 錐形瓶中,加入50ml 0.5×TBE 稀釋緩沖液,放入微波爐里(或電爐上)加熱至瓊脂糖全部熔化,取出搖勻,此為0.8％瓊脂糖凝膠液。加熱過程中要不時搖動,使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進入溶液。加熱時應蓋上封口膜,以減少水份蒸發。
　　3、膠板的制備：將有機玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏(寬約1cm)緊密封住。將封好的膠槽置于水平支持物上,插上樣品梳子,注意觀察梳子齒下緣應與膠槽底面保持1mm 左右的間隙。向冷卻至50-60℃的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(E 溶液使其終濃度為0.5μg /ml(也可不把EB 加入凝膠中,而是電泳后再用0.5μg/ml 的EB 溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內側,待瓊脂糖溶液凝后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內,使膠液形成均勻的膠層。倒膠時的溫度不可太低,否則凝固不均勻,速度也不可太快,否則容易出現氣泡。待膠完全凝固后撥出梳子,注意不要損傷梳底部的凝膠,然后向槽內加入0.5×TBE 稀釋緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。因邊緣效應樣品槽附近會有一些隆起,阻礙緩沖液進入樣品槽中,所以要注意保證樣品槽中應注滿緩沖液。
　　4、加樣：取10μl 酶解液與2μl 6×載樣液混勻,用微量移液槍小心加入樣品槽中。若DNA 含量偏低,則可依上述比例增加上樣量,但總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個樣品要更換tip 頭,以防止互相污染,注意上樣時要小心操作,避免損壞凝膠或將樣品槽底部凝膠刺穿。
　　5、電泳：加完樣后,合上電泳槽蓋,立即接通電源。控制電壓保持在60-80V,電流在40mA 以上。當溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿約2cm 時,停止電泳。
　　6、染色：未加EB 的膠板在電泳完畢后移入0.5μg/ml 的EB 溶液中,室溫下染色20-25 分鐘。
　　7、觀察和拍照：在波長為254nm 的長波長紫外燈下觀察染色后的或已加有EB 的電泳膠板。DNA 存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。紫光燈下觀察時應戴上防護眼鏡或有機玻璃面罩,以免損傷眼睛。經照相機鏡頭加上近攝鏡片和紅色濾光片后將相機固定于照相架上，采用全色膠片，光圈5.6,曝光時間10-120 秒(根據熒光條帶的深淺選擇)。
　　8、DNA 分子量標準曲線的制作：在放大的電泳照片上,以樣品槽為起點,用卡尺測量λDNA 的EcoRⅠ和HindⅢ酶切片段的遷移距離,以厘米為單位。以核苷酸數的常用對數為縱坐標,以遷移距離為橫坐標,在坐標紙上繪出連結各點的平滑曲線,即為該電泳條件下DNA 分子量的標準曲線。
　　9、DNA 酶切片段大小的測定：在放大的電泳照片上,用卡尺量出DNA 樣品各片段的遷移距離,根據此數值,在DNA 分子量標準曲線上查出相應的對數值,進一步計算出各片段的分子量大小(若用單對數坐標紙來繪制標準曲線,則可根據遷移距離直接查出DNA 片段的大小)。反之,若已知DNA 片段的大小亦可由標準曲線上查出它預計的遷移距離。
　　10、DNA 酶切片段排列順序的確定：根據單酶切,雙酶切和多酶切的電泳分析結果,對照DNA 酶切片段大小的數據進行邏輯推理,然后確定各酶切片段的排列順序和各酶切位點的相對位置。以環狀圖或直線圖表示,即成該DNA 分子的限制性內切酶圖譜。
[注意] 1.酶切時所加的DNA 溶液體積不能太大，否則DNA 溶液中其他成分會干擾酶反應。
　　　2、酶活力通常用酶單位（U）表示，酶單位的定義是：在最適反應條件下，1 小時完全降解1mglDNA 的酶量為一個單位，但是許多實驗制備的DNA 不象lDNA 那樣易于降解，需適當增加酶的使用量。反應液中加入過量的酶是不合適的，除考慮成本外，酶液中的微量雜質可能干擾隨后的反應。
　　　3、市場銷售的酶一般濃度很大，為節約起見，使用時可事先用酶反應緩沖液（1×）進行稀釋。另外，酶通常保存在50%的甘油中，實驗中，應將反應液中甘油濃度控制在1/10 之下，否則，酶活性將受影響。
　　　4、觀察DNA 離不開紫外透射儀,可是紫外光對DNA 分子有切割作用。從膠上回收DNA 時,應盡量縮短光照時間并采用長波長紫外燈(300-360nm）,以減少紫外光切割DNA。
　　　5、EB 是強誘變劑并有中等毒性,配制和使用時都應戴手套,并且不要把EB 灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB 的容器或物品必須經專門處理后才能清洗或丟棄。
　　　6、當EB 太多,膠染色過深,DNA 帶看不清時,可將膠放入蒸餾水沖泡,30 分鐘后再觀察。

思考題
1. 如果一個DNA 酶解液在電泳后發現DNA 未被切動, 你認為可能是什么原因？
2. 瓊脂糖凝膠電泳中DNA 分子遷移率受哪些因素的影響？

第三章大腸桿菌感受態細胞的制備和轉化

第一節概述

　　在自然條件下,很多質粒都可通過細菌接合作用轉移到新的宿主內,但在人工構建的質粒載體中,一般缺乏此種轉移所必需的mob 基因,因此不能自行完成從一個細胞到另一個細胞的接合轉移。如需將質粒載體轉移進受體細菌，需誘導受體細菌產生一種短暫的感受態以攝取外源DNA。

　　轉化(Transformation)是將外源DNA 分子引入受體細胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領域的基本實驗技術。

　　轉化過程所用的受體細胞一般是限制修飾系統缺陷的變異株，即不含限制性內切酶和甲基化酶的突變體(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA 分子進入體內并穩定地遺傳給后代。受體細胞經過一些特殊方法(如電擊法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化學試劑法)的處理后,細胞膜的通透性發生了暫時性的改變,成為能允許外源DNA 分子進入的感受態細胞(Compenent cells)。進入受體細胞的DNA 分子通過復制,表達實
現遺傳信息的轉移,使受體細胞出現新的遺傳性狀。將經過轉化后的細胞在篩選培養基中培養，即可篩選出轉化子(Transformant,即帶有異源DNA 分子的受體細胞)。目前常用的感受態細胞制備方法有CaCl2 和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制備的感受態細胞轉化效率較高,但CaCl2 法簡便易行,且其轉化效率完全可以滿足一般實驗的要求,制備出的感受態細胞暫時不用時,可加入占總體積15％的無菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2 法為使用更廣泛。

　　為了提高轉化效率, 實驗中要考慮以下幾個重要因素：
1. 細胞生長狀態和密度: 不要用經過多次轉接或儲于４℃的培養菌，最好從－70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉接用于制備感受態細胞的菌液。細胞生長密度以剛進入對數生長期時為好，可通過監測培養液的OD600 來控制。DH5α菌株的OD600 為0.5 時,細胞密度在5×107 個/ml 左右(不同的菌株情況有所不同),這時比較合適。密度過高或不足均會影響轉化效率。
2. 質粒的質量和濃度: 用于轉化的質粒DNA 應主要是超螺旋態DNA(cccDNA)。轉化效率與外源DNA 的濃度在一定范圍內成正比,但當加入的外源DNA 的量過多或體積過大時,轉化效率就會降低。1ng 的cccDNA 即可使50μl 的感受態細胞達到飽和。一般情況下,DNA 溶液的體積不應超過感受態細胞體積的5％。
3. 試劑的質量: 所用的試劑,如CaCl2 等均需是最高純度的(GR.或AR.),并用超純水配制,最好分裝保存于干燥的冷暗處。
4. 防止雜菌和雜DNA 的污染：整個操作過程均應在無菌條件下進行, 所用器皿, 如離心管, tip頭等最好是新的,并經高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA 酶或雜DNA所污染, 否則均會影響轉化效率或雜DNA 的轉入, 為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。本實驗以E.coli DH5a 菌株為受體細胞,并用CaCl2 處理,使其處于感受態,然后與pBS 質粒共保溫,實現轉化。由于pBS 質粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Ampr )，可通過Amp 抗性來篩選轉化子。如受體細胞沒有轉入pBS，則在含Amp 的培養基上不能生長。能在Amp 培養基上生長的受體細胞（轉化子）肯定已導入了pBS。轉化子擴增后，可將轉化的質粒提取出，進行電泳、酶切等進一步鑒定。本實驗以E.coli DH5a 菌株為受體細胞,并用CaCl2 處理,使其處于感受態,然后與pBS 質粒共保溫,實現轉化。由于pBS 質粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Ampr )，可通過Amp 抗性來篩選轉化子。如受體細胞沒有轉入pBS，則在含Amp 的培養基上不能生長。能在Amp 培養基上生長的受體細胞（轉化子）肯定已導入了pBS。轉化子擴增后，可將轉化的質粒提取出，進行電泳、酶切等進一步鑒定。

第二節材料、設備及試劑

一. 材料
　　E. coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS 質粒DNA: 購買或實驗室自制，eppendorf 管。

二. 設備<