第二講 染色體與DNA
一、 DNA的組成與結構
Avery在1944年的研究報告中寫道："當溶液中酒精的體積達到9/10時，有纖維狀物質析出。如稍加攪拌，它就會象棉線在線軸上一樣繞在硬棒上，溶液中的其它成份則呈顆粒狀沉淀。溶解纖維狀物質并重復數次，可提高其純度。這一物質具有很強的生物學活性，初步實驗證實，它很可能就是DNA（誰能想到！）"。對DNA分子的物理化學研究導致了現代生物學翻天覆地的革命，這更是Avery所沒有想到。
所謂DNA的一級結構，就是指4種核苷酸的連接及其排列順序，表示了該DNA分子的化學構成。核苷酸序列對DNA高級結構的形成有很大影響，如B-DNA中多聚（G-C）區易出現左手螺旋DNA（Z-DNA），而反向重復的DNA片段易出現發卡式結構等。DNA不僅具有嚴格的化學組成，還具有特殊的高級結構，它主要以有規則的雙螺旋形式存在，其基本特點是：
1、DNA分子是由兩條互相平行的脫氧核苷酸長鏈盤繞而成的。
2、DNA分子中的脫氧核糖和磷酸交替連接，排在外側，構成基本骨架，堿基排列在內側。
3、兩條鏈上的堿基通過氫鍵相結合，形成堿基對，它的組成有一定的規律。這就是嘌呤與嘧啶配對，而且腺嘌呤（A）只能與胸腺嘧啶（T）配對，鳥嘌呤（G）只能與胞嘧啶（C）配對。如一條鏈上某一堿基是C，另一條鏈上與它配對的堿基必定是G。堿基之間的這種一一對應的關系叫堿基互補配對原則。組成DNA分子的堿基雖然只有4種，它們的配對方式也只有A與T，C與G兩種，但是，由于堿基可以任何順序排列，構成了DNA分子的多樣性。例如，某DNA分子的一條多核苷酸鏈有100個不同的堿基組成，它們的可能排列方式就是4100。
二、 DNA聚合酶與DNA的合成
The accuracy of translation relies on the
specificity of base pairing. The actual rate in bacteria seems to be
--10-8-10-10. This corresponds to -1 error per genome per 1000 bacterial
replication cycles, or -10-6 per gene per generation.
DNA polymerase might improve the specificity of complementary base selection at either (or both) of two stages:
1，It
could scrutinize the incoming base for the proper complementarity with
the template base; for example, by specifically recongnizing matching
chemical features. This would be a presynthetic error control.
2，Or
it could scrutinize the base pair after the new base has been added to
the chain, and, in those cases in which a mistake has been made, remove
the most recently added base. This would be a proofreading control.
三、DNA的生理意義及成分分析
早在1928年英國科學家Griffith等人就發現肺炎鏈球菌使小鼠殘廢的原因是引起肺炎。細菌的毒性（致病力）是由細胞表面莢膜中的多糖所決定的。具有光滑外表的S型肺炎鏈球菌因為帶有莢膜多糖而都能使小鼠發病，而具有粗糙外表的R型因為沒有莢膜多糖而失去致病力（莢膜多糖能保護細菌免受運動白細胞攻擊）。
首先用實驗證明基因就是DNA分子的是美國著名的微生物學家Avery。Avery等人將光滑型致病菌（S型）燒煮殺滅活性以后再侵染小鼠，發現這些死細菌自然喪失了致病能力。再用活的粗糙型細菌（R型）來侵染小鼠，也不能使之發病，因為粗糙型細菌天然無致病力。當他們將經燒煮殺死的S型細菌和活的R型細菌混合再感染小鼠時，實驗小鼠每次都死了。解剖死鼠，發現有大量活的S型（而不是R型）細菌。他們推測，死細菌中的某一成分棗轉化源（transforming
principle）將無致病力的細菌轉化成病原細菌。
美國冷泉港卡內基遺傳學實驗室科學家Hershey和他的學生Chase在1952年從事噬菌體侵染細菌的實驗。噬菌體專門寄生在細菌體內。它的頭、尾外部都有由蛋白質組成的外殼，頭內主要是DNA。噬菌體侵染細菌的過程可以分為以下5個步驟：①噬菌體用尾部的末端（基片、尾絲）吸附在細菌表面；②噬菌體通過尾軸把DNA全部注入細菌細胞內，噬菌體的蛋白質外殼則留在細胞外面；③噬菌體的DNA一旦進入細菌體內，它就能利用細菌的生命過程合成噬菌體自身的DNA和蛋白質；④新合成的DNA和蛋白質外殼，能組裝成許許多多與親代完全相同的子噬菌體；⑤子代噬菌體由于細菌的解體而被釋放出來，再去侵染其他細菌。他們發現被感染的細菌中帶有70%的噬菌體DNA，但只帶有20%的噬菌體蛋白質。子代噬菌體中帶有50%標記的DNA，卻只有1%的標記蛋白質。
四. C-value和Cot1/2
The total amount of DNA in the haploid genome is a characteristic of each living species known as C-value.
Cot1/2 is the product of concentration and time required for 50% reassociation given in nucleotide-moles × second/liter.
五、 染色體結構
DNA
molecules are the largest macromolecules in the cell and are commonly
packaged into structures called “chromosomes”, most bacteria &
viruses have a single chromosome where as Eukaryotic cells usually
contain many.
任何一條染色體上都帶有許多基因，一條高等生物的染色體上可能帶有成千上萬個基因，一個細胞中的全部基因序列及其間隔序列統稱為genomes（基因組）。
如果設想將人體細胞中的DNA分子繞地球一周，那么，每個堿基大約只占1－5厘米，而一個2－3kb的基因只相當于地球上一條數十米長，數厘米寬的線段！
Genotype (基因型)： The genetic constitution of a given organism (指某個特定生物體細胞內的全部遺傳物質)。
Phenotype (表現型)： Visible property of any given organism (某個特定生物體中可觀察到的物理或生理現象)。
Mutations： 染色體DNA中可遺傳的核苷酸序列變化。
六、 染色體的組成
1．染色質和核小體
染色質DNA的Tm值比自由DNA高，說明在染色質中DNA極可能與蛋白質分子相互作用；在染色質狀態下，由DNA聚合酶和RNA聚合酶催化的DNA復制和轉錄活性大大低于在自由DNA中的反應；DNA酶I（DNaseI）對染色質DNA的消化遠遠慢于對純DNA的作用。染色質的電子顯微鏡圖顯示出由核小體組成的念珠狀結構，可以看到由一條細絲連接著的一連串直徑為10nm的球狀體。
核小體是由H2A、H2B、H3、H4各兩個分子生成的八聚體和由大約200bpDNA組成的。八聚體在中間，DNA分子盤繞在外，而H1則在核小體的外面。每個核小體只有一個H1。
在核小體中DNA盤繞組蛋白八聚體核心，從而使分子收縮成1/7，200bpDNA的長度約為68nm，卻被壓縮在10nm的核小體中。但是，人中期染色體中含3.3×109堿基對，其理論長度應是180cm，這么長的DNA被包含在46個51μm長的圓柱體（染色體）中，其壓縮比約為104。
2．染色體中的核酸組成
⑴不重復序列
在單倍體基因組里，這些序列一般只有一個或幾個拷貝，它占DNA總量的40%－80%。不重復序列長約750－2000dp，相當于一個結構基因的長度。單拷貝基因通過基因擴增仍可合成大量的蛋白質，如一個蠶絲心蛋白基因可作為模板合成104個絲心蛋白mRNA，每個mRNA可存活4d，共合成105個絲心蛋白，這樣，在幾天之內，一個單拷貝絲心蛋白基因就可以合成109個絲心蛋白分子
。
⑵中度重復序列 這類重復序列的重復次數在10－104之間，占總DNA的10%－40%。各種rRNA、tRNA 及組蛋白基因等都屬這一類。
非洲爪蟾的18S、5.8S及28SrRNA基因是連在一起的，中間隔著不轉錄的間隔區，這些單位在DNA鏈上串聯重復約5000次。在卵細胞形成過程中這些基因可進行幾千次不同比例的復制，產生2×106個拷貝，使rDNA占卵細胞DNA的75%，從而使該細胞能積累1012個核糖體。
⑶高度重復序列——衛星DNA
這類DNA只在真核生物中發現，占基因組的10%—60%，由6—100個堿基組成，在DNA鏈上串聯重復幾百萬次。由于堿基的組成不同，在CsCl密度梯度離心中易與其他DNA分開，形成含量較大的主峰及高度重復序列小峰，后者又稱衛星區帶（峰）。
高等真核生物DNA無論從結構還是功能看都極為復雜，以小鼠為例：
1.小鼠總DNA的10％是小于10bp的高度重復序列，重復數十萬到上百萬次/genome。
2.總DNA的20％是重復數千次、長約數百bp的中等重復序列。
3.總DNA的70％是不重復或低重復序列,絕大部分功能基因都位于這類序列中。
Centromere：是細胞有絲分裂期間紡錘體蛋白質與染色體的結合位點（attachment
point），這種結合對于染色體對在子細胞中的有序和平均分配至關重要。在酵母中，centromere的功能單位長約130 bp，富含AT
堿基對。在高等真核細胞中，centromere都是由長約5－10 bp、方向相同的高度重復序列所組成。
Telomeres are sequences at the ends of eukaryotic Chromosomes that help stabilize them。 酵母Telomeres一般以100 bp左右不精確重復序列所組成。
5’(TxGy)n
3’(AxCy)n
其中X、Y一般為1－4，單細胞真核生物中n常為20－100，高等真核生物中>1500。
染色體末端的線性重復序列不能被DNA polymarase 所準確復制，它們一般在DNA復制完成以后由telomarase合成后加到染色體末端。
Alu（長約300bp）是人類高度重復序列,因為該序列中帶有AluI的識別序列而得名。數十萬個Alu重復序列散布于整個人類基因組中，達到總序列的1－3％。Alu與其它高度重復序列共占人類DNA的10％以上。
3．染色體中的蛋白質
染色體上的蛋白質包括組蛋白和非組蛋白。組蛋白是染色體的結構蛋白，它與DNA組成核小體。通常可以用2mol/L
NaCl或0.25mol/L的HCl/H2SO4處理使組蛋白與DNA分開。組蛋白分為H1、H2A、H2B、H3及H4。這些組蛋白都含有大量的賴氨酸和精氨酸，其中H3、H4富含精氨酸，H1富含賴氨酸；H2A、H2B介于兩者之間。
⑴組蛋白的一般特性
進化上的極端保守性。牛、豬、大鼠的H4氨基酸序列完全相同。牛的H4序列與豌豆序列相比只有兩個氨基酸的差異（豌豆H4中的異亮氨基酸60→纈氨酸60，精氨酸→賴氨酸）。H3的保守性也很大，鯉魚與小牛胸腺的H3只差一個氨基酸，小牛胸腺與豌豆H3只差4個氨基酸。
無組織特異性。到目前為止，僅發現鳥類、魚類及兩棲類紅細胞染色體不含H1而帶有H5，精細胞染色體的組蛋白是魚精蛋白。
肽鏈上氨基酸分布的不對稱性。堿性氨基酸集中分布在N端的半條鏈上。例如，N端的半條鏈上凈電荷為+16，C端只有+3，大部分疏水基團都分布在C端。
組蛋白的修飾作用。包括甲基化、乙基化、磷酸化及ADP核糖基化等。
⑵非組蛋白的一般特性
染色體上除了存在大約與DNA等量的組蛋白以外，還存在大量的非組蛋白。非組蛋白的多樣性。非組蛋白的量大約是組蛋白的60%～70%，但它的種類卻很多，約在20-100種之間，其中常見的有15-20種。 非組蛋白的組織專一性和種屬專一性。
(3)幾類常見的非組蛋白
a.HMG蛋白（high mobility group protein）。這是一類能用低鹽（0.35mol/L NaCl）溶液抽提、能溶于2%的三氯乙酸、相對分子質量較低的非組蛋白，相對分子質量都在3.0×104以下。
b. DNA結合蛋白。用2mol/L NaCl除去全部組蛋白和70%非組蛋白后，還有一部分蛋白必須用2mol/L NaCl和5mol/L尿素才能與DNA解離。這些蛋白分子量較低，約占非組蛋白的20%，染色質的8%。
七. 原核與真核染色體DNA比較
原核生物中一般只有一條染色體且大都帶有單拷貝基因，只有很少數基因〔如rRNA基因〕是以多拷貝形式存在；
整個染色體DNA幾乎全部由功能基因與調控序列所組成；
幾乎每個基因序列都與它所編碼的蛋白質序列呈線性對應狀態。
Viral DNA molecules are relatively small
HIV = 9000 nt RNA
Qβ = 4200 nt
Bactaria DNA is 100 times > than viral
E. coli 4639221 bp double-stranded
Contour length = 1.7mm, 850倍細菌本身長度。細菌中常常帶有質粒DNA。
Eucaryotic cells
果蠅帶有25倍于E.
Coli 的DNA,人類帶有600倍于E. Coli 的DNA. Eucaryotic DNA
中基因密度明顯低于原核和病毒。如人DNA中平均每毫米只帶有50個基因,而E.
Coli中基因密度每毫米DNA帶有2400個基因！一個人細胞中所帶有的DNA約有2m/1.7mm細菌。成人帶有1X10^14個細胞，成人體內全部DNA的總長度（Contour
Length）＝ 2X10^11Km