4． DNA序列分析
a. Sanger的雙脫氧鏈終止法
Cambridge的F. Sanger在1977年發明用雙脫氧鏈終止法測定單鏈DNA的序列，其基本原理如下：
①DNA聚合酶能夠用單鏈DNA作為模板，合成準確的DNA互補鏈；②該酶能夠用2'，3'--雙脫氧核苷三磷酸作底物并將其聚合到新生寡核苷酸鏈的3'-末端，從而終止其延伸反應。在DNA測序反應中，加入模板DNA，引物（特異性引物，如T7，T3，M13等），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC和一種ddNTP。常用Klenow大片段，無5'→3'外切酶活性。
b． Maxam-Gilbert化學修飾法(哈佛大學)
該方法的基本原理是用化學試劑處理具有末端放射性標記的DNA片段，造成堿基的特異性切割并產生一組具有不同長度的DNA鏈降解產物，經凝膠電泳分離和放射自顯影之后，可直接讀出待測DNA片段的核苷酸序列。
該反應的關鍵在于使DNA的4種核苷酸中，只有1-2種發生特異性的化學切割反應：
堿基的特異性修飾；
被修飾的堿基從核糖環上轉移；
失去堿基的糖環部位發生DNA鏈斷裂。
專門用來對核苷酸作化學修飾，并打斷磷酸二酯鍵的化學試劑有硫酸二甲酯(dimethylsulphate)和肼(hydrazine)。
硫酸二甲酯是堿性化學試劑，能使DNA鏈中鳥嘌呤的N7和腺嘌呤的N6位發生甲基化，在中性PH環境中就能使糖苷鍵發生水解，并引起DNA鏈的斷裂。在堿性條件下，肼能特異性切割C和T。如果加入1 mol/L的Nacl，那么，只有C被特異性切割。
c． DNA序列分析自動化
用四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine)作為熒光劑標記DNA引物，帶有這種引物的DNA片段能在激光誘導下發出熒光。按照標準的雙脫氧終止法或化學終止法進行測序反應，跑DNA凝膠后用計算機檢測。
d.DNA雜交測序法(SBH-Sequencing by hybridization)
如果一段較短的DNA探針能與較長的DNA片段雜交，并形成完全的雙鏈結構，我們就推測在靶DNA上存在著相應的互補序列，這就是DNA雜交測序法的基本原理。如果將一種12-mer的靶DNA與完全隨機合成的8-mer寡核苷酸控針混合雜交，在總數為48=65536種8-mer的控針群體中，僅有5種探針會與靶DNA雜交，形成完全互補的雙鏈分子。
當靶DNA與標記探針形成G-T或G-A末端堿基錯配的雙鏈體時，檢測有一定難度。寡核苷酸探針越短，堿基錯配造成的去穩定效應越明顯，較易與完全的雙鏈體分子相區分。但是，探針短，雜交產物的總體穩定性下降，信/噪比下降，影響結果的可靠性。所以，6-mer寡核苷酸矩陣芯片只能用于測定500bp的靶DNA；7-mer=2000bp，8-mer=8000bp。
SBH的應用：
① 可有效檢測靶DNA中的單堿基突變；
② 可用于不同DNA片段之間的序列比較；
③ 可用于檢測不同生長發育狀態下細胞中特定基因的表達狀況；
④ 可用于檢驗傳統測序技術的準確性。
5． 基因的定點誘變（site-directed mutagenesis）
使已克隆基因或DNA片段中的任何一個特定堿基發生取代、插入或缺失變化的過程叫作基因的定點誘變，是基因工程和蛋白質工程的重要手段。
a. 盒式誘變(cassette mutagenesis)，包括盒式取代誘變和混合寡核苷酸誘變兩種方式。
b．寡核苷酸引物誘變
應用化學合成的含有突變堿基的寡核苷酸短片段做引物，進行DNA復制，使寡核苷酸引物成為新合成的DNA子鏈的一個部分。
C．PCRG與PCR誘變
6． 利用DNA與蛋白質的相互作用進行核酸研究.
a.凝膠滯緩實驗(Gel retardation assay)，又稱DNA遷移率變化試驗(DNA mobility shift assay--EMSA)。
b． DNase I 印跡試驗（DNase I foot printing）
主要步驟：
① 用32P標記DNA雙鏈末端，并用RE切去一端；
② 加入細胞特定周期蛋白質提取物，溫育；
③ 加入適量DNaseI或硫酸二甲酯-六氫吡啶，使DNA鏈發生斷裂。
這一反應中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常關鍵，要保證一條鏈只發生一次斷裂！
④沉淀DNA（包括與DNA相結合的蛋白質）；
⑤進行DNA凝膠分析。
如果某個蛋白質已經與DNA的特定區段相結合，那么，它就會保證該區段DNA免受消化或降解作用。在電泳凝膠的放射自顯影圖片上，相應于蛋白質結合的部位不產生放射性標記的條帶。
c． 甲基化干擾試驗(Methylation interference assay)
用DMS處理靶DNA，使平均每條鏈上只有一個G被甲基化。將局部甲基化的DNA與含DNA結合蛋白的細胞提取物共溫育后進行凝膠滯緩試驗。分離各種DNA條帶，并用六氫吡啶切割甲基化的殘基。如果因某個G殘基的甲基化作用而阻止了蛋白質與DNA的結合，那么，六氫吡啶對這個甲基化G殘基的切割作用，就只能在沒有蛋白質結合的DNA中觀察到。
d． 體內足跡試驗
用適量DMS處理完整的游離細胞，使染色質中的G殘基甲基化，提取DNA并加入六氫吡啶切割DNA鏈。與對照的裸露DNA經甲基化處理后形成的梯度相對照，就能發現DNA鏈上的蛋白質結合區。
三、分子克隆技術
1、高質量mRNA的制備
應用Promega
PolyAT tract mRNA Isolation System分離Poly(A)RNA。將Biotinylated
Oligo(dT)引物與細胞總RNA共溫育，加入與微磁球相連的Streptavidin，用磁場吸附與PMP相連的SA-Biotinylated
Oligo(dT)-mRNA。
2． 反轉錄成cDNA
可同時在反轉錄系統中加入Oligo（dT）12-18-mer及隨機引物R6，以保證得到全長cDNA；
應選用活性較高的反轉錄酶（Reverse transcriptase）；
應選用甲基化dCTP；
應保證所獲得雙鏈cDNA的方向性。
Super Script Choice cDNA合成系統中所用的poly（dT）引物
因為絕大多數大腸桿菌細胞都會切除帶有5'-methyl C的外源DNA，所以，應選用mcrA- mcrB-菌株。
3．分子克隆的主要方法
（1）構建cDNA、核DNA文庫，應用現有核酸探針分離新的目的基因；
（2）差式雜交(differential screen)和扣除雜交(subtractive hybridization)技術；
（3）DD-RT-PCR法及差別顯示技術；
（4）差別分析法 (RDA法，即Representational difference analysis）；
（5）酵母雙雜交體系Two-hybrid system；
（6）圖位克隆法（map-based cloning）與染色體步移 （genomic DNA Walking）。
習慣上，人們用克隆表示由同一物種具有相同基因型的兩個或多個個體組成的群體。所以，從同一受精卵分裂而來的單卵雙生子（monozygotic
twins）便屬于同一克隆。細胞學上，克隆是指由同一個祖細胞（progenitor
cell）分裂而來的具有同一遺傳背景的子細胞群體。分子生物學上，把將外源DNA插入具有自主復制能力的載體DNA中，使之得以自主復制和永久保存的過程叫做分子克隆。
文庫篩選與基因豐度有關。高豐度基因，如蠶絲心蛋白，卵清蛋白等在某些特定組織中可占細胞總mRNA量的50-90%，非常容易被分離。低豐度基因，一般在細胞中只有10-20個拷貝，哺乳動物細胞中可含10,000到40,000種不同的mRNA，如果要達到99%的期望值，大約需要篩選150,000-170,000個克隆子。一般情況下，每微克cDNA可產生10萬-60萬個克隆子。
A.差式雜交或扣除雜交克隆技術
B.cRNA差式顯示法
除了極少數特例(如組蛋白基因)之外，幾乎所有的真核基因mRNA分子的3'-末端，都帶有一段多聚的腺苷酸結構，即通常所說的poly(A)尾巴。
P.Liang等人設計合成了全部12種不同的引物，用以反轉錄mRNA，合成第一鏈cDNA。這種引物通常叫作3'-端錨定脫氧核苷酸引物，并用5'-T11MN或5'-T12MN通式表示。其中M為除了T以外的任何一種核苷酸（即A、G或C），而N則為任何一種核苷酸（即A、G、C或T），故MN共有12種不同的排列組合方式。
DDRT-PCR的主要步驟：
Ⅰ.從不同發育階段或不同基因型的細胞群體中分離mRNA，并以3'錨定引物作為反轉錄的引物，合成第一鍵cDNA；
Ⅱ.用5'隨機引物和某個3'端錨定引物對擴增第一鏈(摻入32p-dNTP)；
Ⅲ.用DNA變性測序膠分離擴增產物，X光片曝光后檢測差別條帶；
Ⅳ.回收特異性差別條帶；
Ⅴ.用同一引物對擴增已回收的DNA條帶；
Ⅵ.用Northern，Southern及測序法分析所得的條帶；
Ⅶ.以該DNA片段做探針，篩選全長cDNA或核基因。
C.cDNA差式分析法(Representational ditterence analysis)
RDA法充分發揮了PCR以指數形式擴增雙鏈DNA模板的特性，通過降低cDNA群體復雜性和更換cDNA兩端接頭等方法，特異擴增了目的基因片段。因為試驗對象（Tester）和供試探針（Driver）在接受差式分析前均經一個4堿基切割酶處理，形成平均長度256bp的代表群（representation）保證絕大部分遺傳信息能被擴增。每次T減D反應后僅設置72℃復性與延伸，94℃復性這兩個參數共20個PCR循環，PCR產物的特異性和所得探針的純度非常高。
D.酵母雙雜交體系
Two-hybrid system也叫interaction trap（相互作用陷井），是90年代初發展起來的分離基因的新方法，可用于分離能與已知靶蛋白質（target protein）相互作用的基因。
基本原理：
真核生物的轉錄因子大多是由兩個結構上分開、功能上獨立的結構域組成的。如GAL4的N端1-147aa是DNA結合域（BD），其C端768-881aa是轉錄激活域（AD）。一般情況下，AD能與GAL4效應基因啟動子上游的特定DNA區段（UAS）相結合，而此時，AD則推動了轉錄起始。
若用基因工程的方法，將GAL4 AD和BD分別克隆到不同的載體上，導入同一細胞株中表達，效應基因無法被激活,但可把來自不同轉錄因子的AD或BD區域連成一個功能基因。
主要實驗過程：
a. 選擇缺失GAL4編碼基因的酵母寄主菌株-SFY526或HF7c；
b. 構建帶有GAL1 UAS-啟動子-lac Z（His3）的轉化載體;
c. 把已知的靶蛋白質編碼基因克隆到pGBT9的多克隆位點上，把所有cDNA都克隆到pGAD424載體上，構成cDNA表達文庫。
d. 從大腸桿菌中分別提取這兩種重組質粒DNA，共轉化感受態釀酒酵母菌株。
e. 將共轉化的酵母菌株涂布于缺少Leu，Trp和His的培養基上，篩選表達相互作用的雜種蛋白的陽性菌落。
E.基因的圖位克隆法
Map-based
cloning是分離未知性狀目的基因的一種好方法。從理論上說，所有具有某種表現型的基因都可以通過該方法克隆得到。首先，將目的基因定位到某個染色體的特定位點，并在其兩側確定緊密連鎖的RFLP或RAPD分子標記。二、利用與目的基因最緊密連鎖的一對分子標記作探針，通過染色體步移技術將位于這兩個標記之間的基因片段克隆并分離出來。三、根據基因功能互作原理鑒定目的基因。
通過對許多不同的生態型及大量限制性內切酶和雜交探針的分析，找出與目的基因距離最近的RFLP標記。在RFLP作圖中，連鎖距離是根據重組率來計算的，1cm（厘米）相當于1%的重組率。人類基因組中，1cm≈1000kb;擬南芥菜中，1cm≈290kb;小麥中，
1cm≈3500kb。
四、 DNA的Microarray
只要事先除去高度及中等重復序列，任何DNA都可以被用于Microarray。最簡單的例子是用機械手把極微量（nanoliters）的DNA點到玻片或其它載體上，照射UV
light使之永久固定，用不同細胞周期發育階段的cDNA作探針系統性地研究細胞中任意時期特異表達的基因；若把某一生物體內全部全部已知基因分別點到DNA微列陣或者基因芯片上，再用不同發育階段的cDNA與之雜交，就能了解某些基因對特定生長發育階段的重要性；基因芯片還可用于進行基因診斷，可建立正常人特定組織、器官的基因芯片，給出標準雜交信號圖。用可疑病人的cDNA做探針與之雜交，檢查哪些基因的表達受抑制或激活。
第六講 原核基因表達調控
原核生物和單細胞真核生物直接暴露在變幻莫測的環境中，食物供應毫無保障，只有能根據環境條件的改變合成各種不同的蛋白質，使代謝過程適應環境的變化，才能維持自身的生存和繁衍。自然選擇傾向于保留高效率的生命過程。在一個每30min增殖一倍的109細菌群體中，若有一個細菌變成了29.5min增殖一倍，大約經過80天的連續生長后，這個群體中的99.9%都將具有29.5min增殖一倍的生長速度。
一個大腸桿菌細胞中約有2500-3000個基因。估計正常情況下，可帶有107個蛋白質，平均每個基因產生3000多個蛋白質分子。但大腸桿菌中一般帶有15,000-30,000個核糖體，有50余種核糖體結合蛋白，數量也很驚人。此外，負責糖酵解系統的蛋白質數量也很大。而象半乳糖苷酶等誘導酶，其含量可少至每細胞僅1-5個分子。
一個體系在需要時被打開，不需要時被關閉。這種"開-關"（on-off）活性是通過調節轉錄來建立的，也就是說mRNA的合成是可以被調節的。當我們說一個系統處于"off"狀態時，也有本底水平的基因表達，常常是每世代每個細胞只合成1或2個mRNA分子。所謂"關"實際的意思是基因表達量特別低，很難甚至無法檢測。
科學家把這個從DNA到蛋白質的過程稱為基因表達(gene expression)，對這個過程的調節就稱為基因表達調控(gene regulation或gene control)。要了解動、植物生長發育的規律、形態結構特征和生物學功能，就必須弄清楚基因表達調控的時間和空間概念，掌握了基因表達調控的秘密，我們手中就有了一把揭示生物學奧妙的金鑰匙。
基因表達調控主要表現在以下幾個方面：
① 轉錄水平上的調控(transcriptional regulation)；
② mRNA加工成熟水平上的調控(differential processing of RNA transcript)；
③ 翻譯水平上的調控(differential translation of mRNA).
原核生物中，營養狀況(nutritionalstatus)和環境因素(environmental factor)對基因表達起著舉足輕重的影響。在真核生物尤其是高等真核生物中，激素水平(hormone level)和發育階段(developmental stage)是基因表達調控的最主要手段，營養和環境因素的影響力大為下降。
一、 乳糖操縱子的調控模式
大腸桿菌乳糖操縱子(lactose
operon)包括3個結構基因：Z、Y和A，以及啟動子、控制子和阻遏子等。轉錄時，RNA聚合酶首先與啟動區(promoter,P)結合，通過操縱區(operator,O)向右轉錄。轉錄從O區的中間開始，按Z→Y→A方向進行，每次轉錄出來的一條mRNA上都帶有這3個基因。轉錄的調控是啟動區和操縱區進行的。
Z編碼β-半乳糖苷酶；Y編碼β-半乳糖苷透過酶；A編碼β-半乳糖苷乙酰基轉移酶。β-半乳糖苷酶是一種β-半乳糖苷鍵的專一性酶，除能將乳糖水解成葡萄糖和半乳糖外，還能水解其他β-半乳糖苷（如苯基半乳糖苷）。β-半乳糖苷透過酶的作用是使外界的β-半乳糖苷（如乳糖）能透過大腸桿菌細胞壁和原生質膜進入細胞內。β-半乳糖苷乙酰基轉移酶的作用是把乙酰輔酶A上的乙酰基轉到β-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。
1． 酶的誘導-lac體系受調控的證據
在不含乳糖及β-半乳糖苷的培養基中，lac+基因型每個大腸桿功細胞內大約只有1-2個酶分子。如果在培養基中加入乳糖，酶的濃度很快達到細胞總蛋白量的6%或7%，每個細胞中可有超過105個酶分子。
科學家把大腸桿菌細胞放在加有放射性35S標記的氨基酸但沒有任何半乳糖誘導物的培養基中繁殖幾代，然后再將這些帶有放射活性的細菌轉移到不含35S、無放射性的培養基中，隨著培養基中誘導物的加入，β-半乳糖苷酶便開始合成。分離β-半乳糖苷酶，發現這種酶無35S標記。說明酶的合成不是由前體轉化而來的，而是加入誘導物后新合成的。
已經分離在有誘導物或沒有誘導物的情況下都能產生lacmRNA的突變體，這種失去調節能力的突變體稱為永久型突變體，為分兩類：I型和O型。
I型：野生型為I+，突變型為I-
O型：野生型為O+，突變型為Oc。
I+→I-或O+→Oc后，Z、Y、A結構基因均表現為永久表達，所以I基因被稱為調節基因(regulatory gene)。研究發現，I基因是一個產生阻遏物的調節基因，其產物使體系關閉。I-突變體由于不能產生阻遏物，使細胞成為lac永久表達型。I-/I+局部二倍體由于帶有一個正常阻遏物，使細胞中的lac仍然被抑制。
遺傳學圖譜分析指出，Oc突變位于I與Z之間，所以，lac體系的4個基因的序列為IOZY。通過這些觀察，Jacob和Monod推斷Oc突變代表DNA鏈上的一個位點或一個非編碼區域，而不是一個基因，因為可編碼的基因具有互補性，而Oc沒有這一特性。O決定相鄰Z基因的產物是誘導型合成還是永久型合成，O區域稱為操縱基因。
2. 操縱子模型
Jacob和Monod認為誘導酶（他們當時稱為適應酶）現象是個基因調控問題，可以用實驗方法進行研究，因此選為突破口，終于通過大量實驗及分析，建立了該操縱子的控制模型。
① Z、Y、A基因的產物由同一條多順反子的mRNA分子所編碼。
② 這個mRNA分子的啟動子緊接著O區，而位于I與O之間的啟動子區（P），不能單獨起動合成β-半乳糖苷酶和透過酶的生理過程。
③ 操縱基因是DNA上的一小段序列（僅為26bp），是阻遏物的結合位點。
④當阻遏物與操縱基因結合時，lacmRNA的轉錄起始受到抑制。
⑤誘導物通過與阻遏物結合，改變它的三維構象，使之不能與操縱基因結合，從而激發lacmRNA的合成。當有誘導物存在時，操縱基因區沒有被阻遏物占據，所以啟動子能夠順利起始mRNA的合成。
3. Lac操縱子的本底水平表達
因為誘導物需要穿過細胞膜才能與阻遏物結合，而運轉誘導物需要透過酶。在非誘導狀態下有少量（1-5個mRNA分子）lac mRNA合成--本底水平永久型合成。
4. 葡萄糖對lac操縱子的影響--代謝物阻遏效應
研究表明，葡萄糖對lac操縱子表達的抑制作用是間接的，因為存在一種大腸桿菌突變株，它正常的糖酵解過程受阻，葡萄糖-6-磷酸不能轉化為下一步代謝中間物，該菌株能在有葡萄糖存在的情況下被誘導合成lac mRNA。
5. cAMP與代謝物激活蛋白
當葡萄糖和乳糖同時存在于培養基中時，lac啟動子表達受阻，沒有β-半乳糖苷酶活性；當葡萄糖消耗完以后（圖中箭頭處），細胞內cAMP濃度增加，β-半乳糖苷酶活性被誘導，一度停止生長的細胞又恢復分裂。如果將細菌放在缺乏碳源的培養基中，細胞內cAMP濃度就很高；若在含葡萄糖的培養基中培養，細菌中的cAMP濃度就會很低；如果將細菌置于甘油或乳糖等不進行糖酵解的碳源培養基中，細菌中cAMP的濃度也會很高。
研究證實，葡萄糖所引起的代謝物抑制(Catabolite repression)現象的實質是該代謝物降低了細胞中cAMP的含量.事實上，cAMP-CAP復合物是lac體系的positive regulator，它們不能代替lacI和lacO的功能(negative regulator)。
cAMP-CAP不但能與DNA相結合，造成雙螺旋彎曲，易于形成三元轉錄起始復合物，它還能直接影響RNA聚合酶的活性。Dominant negative（Trans-dominant）lacI-d，只要有這個"環"的亞基存在，lacI+基因產物（阻遏物）無法與O區相結合lac operon得到表達。
6. lac操縱子DNA的調控區域--P.O.區
lac
P（啟動子區）從I基因結束到mRNA轉錄起始位點止，共長82bp（-82～+1）O區就是阻遏物結合區，位于P區后半部分和轉錄起始區（-7～+28），該區序列有對稱性，其對稱中心點在+11位。P區的CAMP-CAP結合區（-67～-52）也有對稱性，其對稱位點在-60～-59之間。
在一個完全被誘導的細胞中，β-半乳糖苷酶、透過酶及乙酰基轉移酶的拷貝數比例為1:0.5:0.2，這個比例在一定程度上反映了以β-半乳糖苷作為唯一碳源時細胞的需要。不同的酶在數量上的差異是由于在翻譯水平上受到調節所致。
①lac mRNA可能與翻譯過程中的核糖體相脫離，從而終止蛋白質鏈的翻譯。這種現象發生的頻率取決于每一個后續的AUG密碼子再度起始翻譯的概率。
②在lac mRNA分子內部，A基因比Z基因?