實驗方法原理 無菌條件下切除孕鼠(已知懷孕時間)子宮,分離胚胎。
實驗材料 DBSS
試劑、試劑盒 70%乙醇
儀器、耗材 培養皿尖鑷子尖剪刀超凈工作臺本生燈
實驗步驟
1. 交配。將分籠的雄鼠和雌鼠合籠進行交配,雌鼠 3 天后可進入動情期,此時交配的成功率最高。這一過程可以有計劃地進行,使胚胎在適宜的時間產生。為確定成功交配的時間需每天早晨檢查雌鼠的陰栓。
2. 計算胚胎發育時間:將發現陰栓的日子定為零天,胚胎發育時間由這一天開始計算。整個孕期約為 19~21 天,分離完整胚胎進行細胞培養的合適時間為第 13 天,此時胚胎已相當大,但仍含有大量的未分化的間充質細胞,這是培養細胞的主要來源。但分離、處理超過妊娠期一半的胚胎可能需要許可證(例如在英國),所以用 9~10 天的胚胎也許更可取。雖然從這種胚胎分離的組織細胞的數目相對少一些,但能夠生長的細胞的比例較高。除了腦和心臟之外的大部分器官于妊娠第 9 天開始形成,11 天之前很難分離。單一器官的分離在第 13~14 天比較容易,大部分器官于第 18 天完全形成。
3. 拉頸處死小鼠(U .K Schedule I procedure),用 70 % 乙醇仔細消毒其腹部表面。
4 . 于膈膜附近的腹中線位置橫向撕開皮膚,向兩側翻開皮膚,顯露未接觸的腹壁。
5. 用無菌剪刀沿腹中線縱行剖開, 露腹腔臟器,此時可見充滿胚胎的子宮位于后腹腔。
6. 取出子宮置于盛有 10 ml 或 20 ml DBSS (取材用BSS (含有高濃度抗生素的BSS(50 ml 盛于無菌燒杯中,用于冷卻燒過的器械)),裝在 25~50 ml 的螺口試管或通用容器內)的 25 ml 或 50 ml 的螺口瓶內。
7. 將未處理的子宮移入培養室,轉人新的培養皿中,內含無菌的 DBSS 。
8. 分離胚胎:
(a) 用兩個無菌鑷子撕開子宮,注意保持鑷子尖閉合,以免過度破壞子宮及對胚胎施加過大壓力。
(b) 將胚胎與胎膜和胎盤剝離,放在培養皿的另一邊,避開血污。
9. 將胚胎轉入新的培養皿中,若有大量的胚胎要取(如 4 或 5 窩以上),可將培養皿置于冰上。
注意事項
1. 將器械浸入乙醇后點燃,即對器械進行消毒時,要十分小心,同時不要將還很熱的器械放回乙醇內!
2. 以上所有步驟應在組織培養室外進行,于小型超凈臺內快速操作將有助于保持無菌。不要把活體動物帶入培養室因為活體動物可帶入污染。若動物尸體需在培養室內處理,必須先浸入乙醇或用乙醇涂抹,用后盡快處理掉。