分離核仁實驗——高鎂法分離核仁

細胞

Dulbecco’s 鹽溶液蔗糖核仁保存液

Teflon-玻璃勻漿器

1. 準備溶液

Dulbecco’s 鹽溶液：

0.136 mol/L NaCl

2.6 mmol/L KCl

8 mmol/L Na₂HPO₄

1.4 mmol/L KH₂PO₄，pH 7.0

蔗糖 A：

0.88 mol/L 蔗糖

12 mmol/L MgCl₂

10 mmol/L Tris ( pH 7.5)

蔗糖 B：

0.88 mol/L 蔗糖

1 mmol/L MgCl₂

10 mmol/L Tris ( pH 7.5)

0.1 moI/L PMSF 異丙醇溶液

核仁保存液：

0.88 mol/L 蔗糖

1 mmol/L MgCl₂

10 mmol/L Tris，50% (v/v) 甘油，pH 7.5

制備時先加入所有成分溶解。用 H₂O 調至 900 ml。最后用 HCl 調 pH 為 7.5，加 H₂O 至終體積為 1 L。

2. 離心收獲細胞，用 Dulbeccc’s 鹽溶液清洗 3 次。

3. 振蕩或用寬松結合的 Teflon-玻璃勻漿器勻漿使細胞重懸浮于蔗糖 A 溶液中。

4. 重懸液用 RC-3 離心機，HG-41 轉頭 1000 g ( 2000 r/min ) 離心 10 分鐘（也可用其他廠家的相應的離心機和轉頭）。

5. 用 2 倍體積的蔗糖溶液 A 重懸浮細胞，超聲處理。

6. 處理后的細胞在 4℃，1200 g 離心 20 分鐘。

7. 吸去上清，留下松散和堅固的沉淀，用蔗糖溶液 B 重懸浮。

8. 細胞核染色質和核仁進行 3~6 個循環的聲波處理。

9. 處理后的懸液在 1200 g 離心 20 分鐘。

10. 通過溫和的搖晃，吹打或用寬松結合的玻璃勻漿器重懸浮核仁。

11. 確定產量，用適當體積的核仁保存液重懸浮核仁。