PCR技術對基因從定性到定量的測定是分子生物學方法研究一大飛躍，定量PCR已成為目前分子生物學技術研究的熱點之一. 迄今研究和應用的定量PCR方法有4種，即PCR產物的直接定量；極限稀釋法；靶基因與參照基因的同步擴增；競爭性PCR法. 以上方法各有利弊，選擇某一方法取決于靶基因的特性，對準確度的要求，需要相對還是絕對的定量. 其中競爭性PCR方法的定量比較準確，被較多地采用［1］. 但該方法在實際應用時，需將恒量的樣品DNA與一系列稀釋檢驗地帶網的各種濃度的競爭性模板混合后進行PCR擴增，最后進行電泳，找出待測模板與競爭性模板終產物有相等摩爾數的一個反應，從而確定待測模板的初始量. 因此，對一個樣品定量時需要進行多個反應，不適應多樣品的同時定量測定. 我們建立了分級定量方法，只用3種濃度的競爭模板與恒定量樣品DNA進行3個PCR反應，通過測定待測模板與競爭模板的終產物熒光強度比值，來確定待測樣品DNA的初始模板量. 該方法適合多樣品同時測定.
目的 利用競爭PCR法建立分級測定HBV DNA含量的定量方法.
方法 設立3個標準競爭模板（102cop, 104 cop, 106cop），分別和恒量的待測模板混合，分別進行40，30，20次循環的PCR擴增，最后凝膠電泳分離待測模板和競爭模板的PCR產物，測定兩者的熒光強度的比值，計算待測模板的初始量.
結果 對乙型肝炎血清HBV DNA定量表明，12份HBeAg陽性血清，HBV DNA的血清濃度在6×107～1×1011cop/L，而12份HBeAb陽性血清只有7份可檢出HBV DNA，它們的血清濃度均在3×108cop/L以下，其余5份用該PCR方法，檢測不到.
結論 該方法可用于HBV DNA以及其他病原體DNA的定量.
Grading quantitative PCR to measure serum HBV DNA levels
GUO Yan-Hai1, REN Feng-Ling2, YAN Xiao-Jun1 ａnd SU Cheng Zhi1
1Chinese PLA Institute of Gene Diagnosis, Xi＇an 710033, Shaanxi Province, China
2Environmental Health Department of Xi＇an Medical University, Xi＇an 710061, Shaanxi Province, China
Subject headings hepatitis B virus; DNA, viral/analysis; polymerase chain reaction
Abstract
AIM To set up a new method of measuring serum HBV DNA levels with grading quantitative PCR.
METHODS Three standard competition DNA templates （102 cop, 104 cop, 106 cop） were mixed separately with stable sample DNA templates, ａnd then PCR with 40, 30 ａnd 20 cycles was carried out. Then the PCR products of the sample DNA templates were separated from that of the competition DNA complates, ａnd the fluorescence intensity ratio of them were measured. The initial contents of the sample DNA templates were calculated.
RESULTS The serum HBV DNA contents of the 12 samples of HBeAg positive serum ranged from 6×107 to 1×1011cop/L. Only 7 of the 12 HBeAb positive serum could be detected ａnd their HBV DNA were all below 3×108cop/L ａnd the other 5 samples HBV DNA could not be detected with PCR.
CONCLUSION This method can be used to measure the HBV DNA ａnd other pathogenic DNA.
1 材料和方法
1.1 材料 GQS-960凝膠成像分析系統（第四軍醫大學基因診斷技術應用研究所），Thermolyne PCR擴增儀（美國）,Taq DNA聚合酶，dNTP （Promega公司）. 引物出自HBV DNA的X區，經oligo軟件設計. 引物位置和序列為：B1（1402-1421），5,-ATC CTGCGCGGGACGTCCTT3；B2（1626-1607）5,-CGTTCACGGTGGTCTCCATG3擴增比較為225bp，由上海深工生物工程公司合成.
1.2 方法 含靶序列的PUC 19質粒和競爭序列的PUC19質粒，將B1，B2引物擴增HBV DNA的產物克隆入PUC19，該質粒作模擬靶序列用；競爭模板是在正常的B1，B2引物擴增產物中央部插入一段人工合成的40bp的DNA片段，并克隆于PUC19，該質粒作定量實驗的競爭模板. 血清處理，主要按酚/氯仿抽提，乙醇沉淀的方法［2］提取血清中HBV DNA，血清用量為300μL，最后所得HBV DNA等分3份作定量PCR擴增. PCR擴增取上述純化的HBV DNA（各5μL）分別加入|檢驗地帶網|三個定量反應管中，其中的競爭模板量分別為102cop,104cop,106cop. PCR反應成分為50mmol/L KCl，100mmol/LTris-HCl pH 8.3，1.5mmol/L MgCl2， 200μmol/L dNTP，B1，B2引物各30pmol. Taq DNA聚合酶1U，反應總體積30μL. 反應程序為：94℃預變性2min，然后94℃ 30s，55℃ 40s, 72℃ 50s分別循環40次，30次，20次后，72℃延伸5min，最后各準確取10μL PCR反應產物，進行40g/L瓊脂糖凝膠電泳［3］. 熒光強度測定：將用溴化乙錠染色的凝膠板置于GQS-960型凝膠呈像分析系統上進行掃描，測定熒光強度比值［4，5］，并用微機計算結果.
2 結果
2.1 競爭模板與待測模板擴增效率比較 對3個待測模板與競爭模板的PCR產物熒光強度比分別為10∶1；1∶1；1∶10的反應液進行106倍稀釋，再各取3μL稀釋后溶液進行PCR擴增，循環30次，結果兩者熒光強度之比仍為10∶1；1∶1；1∶10. 說明所用引物對待測模板與競爭模板的擴增效率相等.
2.2 引物對兩種模板的檢測靈敏度 將提取并純化的含有兩種模板的兩種質粒定量后，按2×105，2×104，2×103，2×102，20 cop分別進行PCR擴增反應，擴增40次循環，結果兩種模板都被檢測到20 cop的模板量.
2.3 標準曲線
2.3.1 標準曲線1 將102 cop的競爭模板分別與20，40，60，80，100，200，400，600，800，1000，2000，4000 cop的待測模板（含靶序列的PUC19質粒）混合后進行40次PCR擴增. 測定待測模板與競爭模板的PCR產物熒光強度之比（Ax/Ao），并以1g（Ax/Ao）作縱坐標，以待測模板初始量的對數lgX為橫坐標作標準曲線1（以下作法相同）.
2.3.2 標準曲線2 將104 cop的競爭模板分別1×103，2×103，4×103，6×103，8×103，1×104，2×104，4×104，6×104，8×104，1×105，2×105，4×105 cop待測模板混合后，分別進行30次PCR擴增，作標準曲線2.
2.3.3 標準曲線3 將106 cop的競爭模板分別1×105，2×105，4×105，6×105，8×105，1×106，2×106，4×106，6×106，8×106，1×107，2×107，4×107 cop的待測模板混合后，分別進行20次PCR擴增，作標準曲線3.
2.4 臨床樣品的檢測結果 用該定量法對24份HBV感染者的血清進行定量測定，其中12份HBeAg 陽性的血清PCR檢測HBV DNA為陽性，HBV DNA在血清中的含量6×107～1×1011/L之間（8×109，6×107，5×1010，4×108，10×1010，5×108，1×1011，7×108，9×108，7×1010,4×109,5×109 cop/L），平均在2.1×1010/L. 而12份HBeAb陽性血清進行測定時，其中7例血清PCR可檢出HBV DNA陽性，HBV DNA在血清中的濃度在2×105～3×108 cop/L（6×106，4×106，2×105，5×105，3×108，7×105，1×106 cop/L）. 而其余7份血清PCR檢測HBV DNA為陰性.
3 討論
用競爭性PCR定量的基本條件是靶序列和競爭性序列用相同的引物，并以相同的效率擴增［1］. 在本實驗中，我們采用一對引物對待測靶序列和競爭序列同時擴增，競爭序列是在靶序列中央插入40bp人工合成的DNA片段而來的，這樣就保證了靶序列與競爭序列有相似性，使擴增效率相接近. 實驗證明，我們設計的競爭模板與待測靶序列有相同的擴增效率，即兩者開始的|檢驗地帶網|比值經擴增后沒有改變，這就保證了本定量實驗的可行性. 插入40bp序列也足以使擴增后的兩種產物能在瓊脂糖凝膠上被分離開. 但這段序列又不能太長，以免擴增效率和待測模板不一致. 在實驗中為了使兩條擴增帶不相干擾，PCR擴增一定要保證特異性擴增. 為此該定量方法要求按嚴格的標本處理方法提模板DNA，同時對不同濃度范圍內的模板按不同的循環次數擴增，即20～103 cop/每管的PCR用40次循環擴增；103～105cop/每管的PCR用30次循環擴增，105～107cop/每管的PCR用20次循環，這樣不僅可以保證低濃度模板能被擴增出來，同時高濃度模板經擴增不易出現非特異擴增帶，這樣就有了定量的前提條件.
該方法的理論基礎為Ax/Ao=（225Yx）/（265Y0）=［225X（1+e）N］/［265M0（1+e）N］. Ax/Ao為待測模板與競爭模板的擴增產物帶熒光強度比；Yx/Yo為待測與競爭模板擴增產物拷貝數之比；225bp為待測模板的長度；265bp為競爭模板的長度；X為待測模板的初始量；Mo為競爭模板初始量；e為擴增效率；n為循環次數. 由于本實驗中兩種模板擴增效率相同，循環次數相同，上式就變為Ax/Ao=225X/265Mo，取對數后為1g（Ax/Ao）=lgX+1g（225/265Mo）. 因此，1gX與1g（Ax/Ao）成線性關系［6］. 但在作分級定量的3個標準曲線時，當靶序列比競爭序列的拷貝數大于10倍以后，標準曲線就漸漸偏離理論值，斜率逐漸增大. 這是由于當待測序列的初始模板量大于競爭序列10倍以上時，經過一定的擴增循環后，待測序列的擴增產物量急劇增大，這些產物所產生的熒光強度已接近或超過了檢測系統的飽和限. 因此Ax值增加幅度很微小，直至飽和，此后Ax的測量值不再變化［7］. 而另一方面由于PCR反應體系中各種成分迅速被大量的待測序列及其產物占有，競爭序列的擴增就受到強烈地限制，最終擴增產物下降到A0值接近0. 因此我們看到隨著待測序列分子數量增加，標準曲線將迅速上升. 為此我們每一級的定量范圍在標準競爭模板量的10±1之間.
在定量測定時，我們采用GQS-960凝膠成像及分析系統，對待測及競爭模板的擴增帶進行熒光強度比較，經微機計算出相應的待測模板拷貝數. 該方法仍采用溴化乙錠染色，紫外燈下測定熒光. 因此過去有定性PCR設備的實驗室，只需購買一套凝膠熒光強度檢測儀就可以開展工作. 該定量法不需象以往競爭PCR定量方法那樣，測定一個樣品DNA要有一系列稀釋的競爭模板來標定，而是只要作3個定量（與102，104，106cop競爭模板混合）反應就可最終定出檢驗地帶網待測DNA模板的拷貝數. 用該方法分別對12份HBeAg陽性和12份HBeAb陽性血清進行定量分析，結果前12份血清均可檢測到HBV DNA，并且血清濃度為6×107～1×1011cop/L. 而后12份只檢出7份HBV DNA陽性，其在血清中的含量在2×105～3×108 cop/L之間，還有5份血清用該PCR方法未檢出HBV DNA. 以上定量結果與文獻報道的相近［3］. 上述結果也說明了為什么用簡便的處理血清方法進行PCR擴增時，HBeAb陽性血清大部分往往檢測不到HBV DNA的原因. 因為一般抗HBeAb陽性血清中HBV DNA含量較低（在3×108 cop/L以下），而簡便血清處理方法最多只取相當于2μL血清中的HBV DNA作PCR擴增，按上面結果計算只含有0.4～6×102 cop. 因此就有一大部分不能被檢測出來.
總之，該方法操作簡便，結果準確，可用于臨床定量檢測各種病原體的DNA.