劃時代的檢測技術——時間分辨熒光分析法（TRFIA）

放射免疫分析（RIA），以其高度特異性靈敏度和實用性，吸引著各國的生物醫學工作者，但操作中始終存在放射性污染、同位素半衰期短及試劑盒穩定性問題。為此，人們發展了一系列非放射性標記技術，如酶標記、化學發光、生物發光標記等技術，其中，時間分辨熒光免疫分析技術。由于靈敏度及線性范圍明顯優于其它技術，最為引人注目。

時間分辨熒光分析法（TRFIA）實際上是在熒光分析（FIA）的基礎上發展起來的，它是一種特殊的熒光分析。普通的熒光分析利用了熒光的波長與其激發波長的巨大差異，克服了普通紫外－可見分光分析法中雜色光的影響，同時，熒光分析與普通分光不同，光電接受器與激發光不在同一直線上，激發光不能直接到達光電接受器，從而大幅度地提高了光學分析的靈敏度。但是，當進行超微量分析的時候，激發光的雜散光的影響就顯得嚴重了。因此，解決激發光的雜散光的影響成了提高靈敏度的瓶頸。解決雜散光影響的最好方法當然是測量時沒有激發光的存在，但是普通的熒光標志物熒光壽命非常短，激發光消失，熒光也消失。不過有非常少的稀土金屬（Eu、Tb、Sm、Dy）的熒光壽命較長，可達1－2ms，能夠滿足測量要求，因此產生了時間分辨熒光分析法，即使用長效熒光標記物，在關閉激發光后再測定熒光強度的分析方法。

一、 時間分辨熒光分析法的優點

時間分辨熒光分析是以稀土離子標記抗原或抗體、核酸探針和細胞等為特征的超靈敏度檢測技術，它克服了酶標記物的不穩定、化學發光僅能一次發光且易受環境干擾、電化學發光的非直接標記等缺點。使非特異性信號降低到可以忽略的程度，達到了極高的信噪比，從而大大地超過了放射性同位素所能達到的靈敏度，且還具有標記物制備簡便、對被標記物的生物活性和結構無影響、儲存時間長、無放射性污染、檢測重復性好、可實現 多種標記及多元測試、操作流程短、標準曲線范圍寬、不受樣品自然熒光干擾和應用范圍十分廣泛等優點，成為繼放射免疫分析之后標記物發展的一個新里程碑。

二、標記物

常用的標記物主要是Eu（銪）和Tb（鋱）等鑭系元素。其中，Eu熒光壽命1ms，在水中不穩定，但加入增強劑后可以克服；Tb熒光壽命 1.6ms，水中穩定，但其熒光波長短、散射嚴重、能量大易使組分分解，因此從測量方法學上看Tb很好，但不適合用于生物分析，故Eu最為常用。

由于常用Eu作為熒光標記，因此增強劑就成了試劑中的重要組成。增強劑原理：利用含絡合劑、表面活性劑的溶液的親水和親脂性同時存在，使Eu在水中處于穩定狀態。現在有些試劑，在絡合Eu在抗體上時已考慮了增強問題，而使用了具有增強作用的新絡合劑，因而有的試劑沒有單獨的增強劑。

三、檢測原理

標記離子的熒光激發光波長范圍較寬，發射光譜峰范圍窄，是類線光譜，這有利于降低本底熒光強度，提高分辨率。激發光和發射光之間有一個較大的 Stokes位移，有利于排除特異熒光的干擾，增強測量的特異性。標記離子螯合物產生的熒光強度高，壽命長，有利于消除樣品及環境中熒光物質對檢測結果的影響。沒一秒鐘檢測樣品1000次，結果取平均值，有利于提高檢測的準確性。

四、檢測參數

靈敏度： 10-18 mol/well(Eu3+)

線性度： 10-18~10-12 mol/well(Eu3+)