因為理論計算的TM值用來確定退火的溫度只是一個參考呀,最合適的退火溫度會因為各種原因而有所差異,就連PCR儀都會有影響的,我們實驗室就是,好多都是在一臺能拉出條帶,而在另一臺上就拉不出條帶,或者相反的。降落(TD)PCR代表了一種完全不同的PCR優化方法。由于開始時的退火溫度選擇高于估計的Tm值,隨著循環的進行,退貨溫度逐漸降到Tm值,并最終低于這個水平。此策略有利于確保第一個引物-模板雜交事件發生在最互補的反應物之間,即那些產生目的擴增產物的反應物之間。盡管退火溫度最終會降到非特異性雜交的Tm值,但此時目的擴增產物已開始幾何擴增,在剩下的循環中處于超過任何滯后(非特異性)PCR產物的地位。
有人研究發現一些本來產生滿意的單一擴增產物的反應采用TD PCR時變得更好進行了。
提醒一下,如果說明書上的Tm值和Oligo或者Primer上分析的差別挺大的,你要以軟件上的計算為準。 我覺的你兩個引物Tm值差的太多,不過你也可試。68度開始,每個循環下降0.5度,或者0.2度,最后62度來個20循環。