圖3直接夾心ELISA原理
對于雙抗夾心ELISA，待檢對象必須包括兩個或者兩個以上的表位，否則檢測抗體無法與待檢抗原結合，例如半抗原和小分子抗原都是不能用雙抗夾心ELISA檢測的。對于雙抗原夾心ELISA，其操作與間接ELISA基本相同，但利用特異性的抗原代替酶標二抗，所以特異性比間接法更好。另外，由于間接ELISA中使用的二抗一般只能識別IgG，而雙抗原夾心ELISA中任何類似的免疫球蛋白都可以被檢測出，因此雙抗原夾心ELISA比間接ELISA也更靈敏。
下面我將結合一些試劑盒舉例說明加拿大(ANOGEN)
human
interleukin-8(IL-8),這個指標試劑盒的用到的系統就是這種直接夾心ELISA,在此基礎上發展了親和素(avidin)生物素(biotin)系統(system)，以生物素標記的抗體（或抗原）代替原ELISA系統中的酶標抗體（抗原），加拿大(ANOGEN)
human interleukin-1β(IL-1β)，TNF-α，IL-6 均用到此體系。
間接夾心ELISA是基于兩種不同種屬來源的抗體的夾心ELISA，其原理是將一種種屬來源的特異性抗體包被于固相載體上（作為捕獲抗體），封閉，加入待檢抗原，溫育，洗滌后加入另一種種屬來源的特異性抗體（非酶標，作為檢測抗體），最后加入酶標二抗（特異性識別檢測抗體），再加底物顯色。間接夾心ELISA的原理如圖4。與直接雙抗夾心ELISA相比，間接夾心ELISA中引入了特異性識別檢測抗體的酶標二抗，相當于整個體系的信號增加了一步放大系統，于是最終的結果比直接雙抗夾心ELISA更靈敏。同時，由于間接夾心ELISA中的酶標二抗僅能識別檢測抗體，而不能識別捕獲抗體，所以體系的特異性也得到了保障。值得提出的是，間接夾心ELISA并不是嚴格要求捕獲抗體與檢測抗體來源于同一物種，也可以是這種情形：僅用特異性的抗體的Fab片段包被固相載體作為捕獲抗體，而用未經處理的同種屬來源的特異性抗體作為檢測抗體，酶標二抗選用只針對檢測抗體的Fc段的二抗，這樣的酶標二抗同樣不能識別捕獲抗體，從而使這種體系里的捕獲抗體與檢測抗體起到類似于不同種屬來源的效果。間接夾心ELISA涉及的體系比較復雜，用到的試劑也比其它的ELISA復雜，但是其檢測靈敏度上的優越性使它在檢測那些低豐度抗原的樣品中應用得十分廣泛。
圖4間接夾心ELISA
【競爭抑制ELISA】
競爭抑制ELISA又叫封閉ELISA，其主要原理是用待檢抗原或抗體去干擾已經預先設計好的體系，最終顯色的結果與待檢抗原或抗體的干擾程度成負相關。競爭抑制ELISA靈活性很強，可以在此基礎上設計出更復雜的實驗方案，從而派生出所謂的直接競爭抑制ELISA、間接競爭抑制ELISA、夾心競爭ELISA等特殊的ELISA方法。這里僅以直接競爭抑制ELISA和間接競爭抑制ELISA為例簡單闡述原理。直接競爭抑制ELISA中，預先將抗原包被在固相載體上，并加入酶標的特異性抗體。實驗時，加入待檢抗原（或抗體），如果待檢對象是抗原，則待檢抗原就與預先包被在固相載體上的抗原競爭結構酶標抗體；如果待檢測對象是抗體，則待檢抗體就與系統中原有的酶標抗體競爭結合包被在固相載體上的抗原。洗滌過程就可以洗掉被競爭下的酶標抗體，最后加底物顯色。最終顯色的結果與待檢原（或抗體）量成反比。直接競爭抑制ELISA的原理如圖5。注意在直接競爭抑制ELISA中，同一預制備的體系既可以測定抗原，也可以測定抗體。
圖5直接競爭抑制ELISA原理
如同間接ELISA一樣，直接競爭抑制ELISA也有兩步信號放大的過程，因此其靈敏度也比較高，但是預先包被好固相載體并加入酶標抗體后，實驗時只需要將待檢抗原或抗體稀釋后加到體系中進行反應即可，大大簡化ELISA的操作過程。用到此系統的試劑盒如德國(LDN)
cortisol，DHEA-S,Estradiol等這些指標。
間接競爭抑制ELISA可以看作是用待檢抗原或待檢抗體干擾一個預先制備的間接ELISA系統。其具體原理是：將抗原包被于固相載體上，依次加入特異性的抗體以及此抗體對應的酶標二抗作為預制備的體系。實驗時，加入稀釋好的待檢抗原（或抗體），待檢標本中的抗原（或抗體）就和預制備體系中固相載體上結合的抗原（或抗體）競爭結合特異性的抗體（或固相載體上結合的抗原）。同間接ELISA一樣，間接競爭抑制ELISA也有三步信號放大以其靈敏度也比直接競爭抑制ELISA高。試劑盒（PHOENIX）ACTH,CRF指標中會用到此系統。
從上述原理可以看出，競爭抑制ELISA對試劑的要求非常少，不管是單抗還是多抗都可以用于實驗，更重要的是不管被檢對象是大分子物質還是多肽、小分子藥物、小分子激素等只有一個表位的分子不能使用夾心ELISA的都可以使用競爭抑制ELISA檢測。另外，像乙肝標志物檢測中，e抗原很不穩定，容易降解變為核心抗原，因此在檢測e抗體時不能用夾心ELISA檢測而只能選用競爭抑制ELISA。
除以上介紹的幾種基本的ELISA外，人們還可以根據自己的實際需要靈活設計其它類型的ELISA，例如引入非酶標二抗或者ProteinA、ProteinG等增加固相載體的載量或者增加系統的特異性等。