利用雙壓線性離子阱質譜儀多重解離技術對API雜質譜進行全面分析
Theresa Lynch 1 ; Kate Comstock 2 ; Jack Cunniff 2
1 Gilead Sciences, 333 Lakeside Dr, Foster City, CA; 2 Thermo Fisher Scientific,
355 River Oaks Parkway, San Jose, CA
前言
活性藥物成分（API）和成品藥的雜質分析是藥物研發中不可或缺的一環。雜質的化學結構信息在評估毒性、改進合成途徑，以及根據目標成藥選擇最佳劑型至關重要。為保證藥效與消費者的安全，世界各國的監管機構都制定了藥物雜質分析的指引，清楚說明基于日服用量、使用時間，和藥物靶標的限量標準。
LCMS 已經成為最常用的未知雜質分析技術。為了能在大量母藥中識別并表征痕量雜質，具有高靈敏度、高掃描速度，并且能進行多級質譜分析（MS n ） 的質譜儀必不可少。在本研究中，Sigma-Aldrich 所售的研究級阿德福韋酯（adefovir dipivoxil，ADP） 被用來作為模型化合物進行 API雜質分析。ADP 是廣泛用于慢性乙肝病毒感染的一種抗病毒處方藥。本研究中使用的 LCMS 系統由 Thermo ScientificAccela TM UHPLC以及 Velos Pro TM 雙壓線性離子阱質譜儀構成。碎片信息通過結合應用 CID 與 Trap-HCD 解離技術獲得。數據處理通過軟件 Mass Frontier TM 完成。
分析方法
材料與試劑
阿德福韋酯（Adefovir dipivoxil，CAS# 142340-99-6）從 Sigma-Aldrich 購得，產品號 A9730。
乙腈和水 （Fisher）；乙酸銨（Sigma-Aldrich，產品號73594-25G-F）；甲酸（Sigma-Aldrich，產品號 33015-
500ml）。
樣品制備
ADP溶液，0.5mg/mL，用 1 ml 20 : 80 的乙腈和水混合溶劑溶解 0.5mg ADP 獲得。
HPLC方法
HPLC系統：Thermo Accela 1250 泵，開放式 Accela 自動進樣器及 Accela PDA
色譜柱： Hypersil GOLD C18 2.1×150 mm，3 μM，
Thermo Scientific 產品號 071399
柱溫：35 ℃
流速：0.5 ml/ 分鐘
進樣體積：8 μl
流動相：A – 水，B – 乙腈，C - 100 mM 乙酸銨，用乙酸調至 pH 5
梯度洗脫：
時間（min） A% B% C%
0 80 10 10
12.0 20 70 10
14.0 20 70 10
14.1 10 80 10
15.0 10 80 10
15.1 80 10 10
19.0 80 10 10
質譜方法
質譜儀：配有 HESI-II 離子源的 Velos Pro TM 雙壓線性離子阱
離子化條件：電噴霧， 正離子模式
1. 全掃模式 m/z 120-1000 amu/ Top5 dd MS/MS，HCD NCE 35%
2. 全掃模式 / 按母離子列表 dd MS 2 / TOP 3 ddMS 3 ,CID/Trap-HCD NCE 20%
a. CID MS 2 / CID MS 3
b. CID MS 2 / HCD MS 3
c. HCD MS 2 / CID MS 3
d. HCD MS 2 / HCD MS
結果與討論
I. 全掃—Top5 HCD dd MS/MS 與“FISh”
ADP 雜質譜分析流程由兩次連續的 LCMS 實驗構成。分析目標是為雜質鑒定和結構解析收集盡可能多的信息。
第一個
MS 實驗包括全掃描和后續的 Top5 HCD 數據依賴MS/MS 掃描（圖 1）。 接下來，數據通過 Mass Frontier 當中的
Fragment Ion
Search（碎片離子檢索，FISh）算法進行處理，這是一個新穎的進行雜質檢出及鑒定的方法，主要基于母離子解離模式的比較（圖
2a，b）。與母藥擁有相同碎片的成分會被“FISh”識別出來，見圖 3。
