利用大引物PCR在同一試管中進行高效快速定點誘變實驗

擴增緩沖液 含有四種 dNTP 的混合溶液 熱穩定 DNA 聚合酶 瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠 正向和反向內引物 誘變引物 模板 DNA

帶屏障裝置的自動移液器用吸頭 微型離心機用離心管 可調式移液器

材料

緩沖液和溶液

貯存液，緩沖液和試劑的成分請參閱附錄 1。
將貯存液稀釋到合適的濃度。

10x 擴增緩沖液

含有四種 dNTP 的混合溶液，每一種 dNTF 的濃度為 2.5 mmol/L

酶和緩沖液

熱穩定 DNA 聚合酶 [Hot-Tub DNA 聚合酶（Amersham) 或同類產品]
大多數 DNA 聚合酶保存在含 50% 甘油的貯存液中。這種溶液非常粘稠，很難準確取量。最簡單的方法是在微型離心機上將含酶的離心管在 4°C 以最大轉速離心 10s, 然后用一個可調式移液器取出所需數量的酶。用一個帶屏障裝置的自動移液器裝配 PCR 反應成分。

凝膠

1% 的瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠（含 0.5ug/ml 溴化乙錠）。

核酸和核苷酸

引物
將正向和反向內引物以 100umol/L(100pmole/ul) 的濃度溶解在水中。
將誘變引物以 10mmol/L(10pmole/ul) 濃度溶解在水中。

模板 DNA

通過溴化乙錠-氯化銫密度梯度離心（第 1 章方案 10 或 11) 或用 Qiagen 樹脂柱層析純化超螺旋雙鏈質粒 DNA(第 1 章方案 9)。將模板 DNA 以 0.1ug/ml 的濃度溶解在 TE(pH8.0) 溶液中。

專用設備

帶屏障裝置的自動移液器用吸頭

微型離心機用離心管（擴增用 0.5 ml 薄壁管）

可調式移液器

可按所需擴增條件設定程序的熱循環儀
如果熱循環儀不配備加熱蓋裝置，使用礦物油或石蠟油以防止 PCR 過程中反應混合物液體揮發。

其他試劑

本方案步驟 6 所需的試劑列在第 1 章方案 17 或 19 中。

方法

1. 使用 0.5 ml 微量離心管或擴增反應管（置冰上），混合下列第一輪擴增反應需要的

試劑：

10X 擴增緩沖液 10ul
質粒 DNA 模板 200~400pg
2.5 mmol/LdNTP 溶液 8ul
誘變引物 10pmoles
低 Tm 值側引物 lOOpmoles
熱穩定 DNA 聚合酶 0.5ul(2.5 單位）
加水至 100ul

如果廠商提供的熱穩定 DNA 聚合酶 10x 擴增緩沖液中不含 MgCl2, 加入所需體積的 0.1mol/L MgCl₂，使反應混合物中含有 DNA 聚合酶反應最適濃度的二價離子。

2. 如果熱循環儀沒有加熱蓋，加入一滴石蠟油（約 50ul) 覆蓋 PCR 反應。將反應管放置在熱循環儀中。

3. 用下表中給出的變性、退火、聚合反應所需的時間和溫度擴增核酸


上述反應條件適合于 0.5 ml 薄壁管和 100ul 反應體積，在 Perkin-Elmer 9600 9700, Master Cycler(Eppendorf) 或 PTC.100 (MJ Research) 熱循環儀上進行：使用其他類型的儀器或不同的反應體積時需調整上述反應條件。每1000bp 長的靶 DNA 聚合反應應進行 1 min。

4. 第一次 PCR 反應完成后再把下列成分加入到同一反應管中：

髙了 Tm 值的側引物 100pmoles
熱穩定 DNA 聚合酶 0.5ul(2.5 個單位）
2.5 mmol/LdNTP 溶液 3ul
用移液器溫和的上下吸打幾次混勻上述反應物。可離心幾秒鐘，將所有的試劑收集到離心管底部。
可以取 3~5ul 第一次 PCR 反應混合物，經瓊脂糖凝膠電泳快速分析證實是否成功的合成了大引物 PCR 產物。

5. 接下來進行第二輪擴增反應，反應由 25 個循環和二步溫度組成：

94°C,40S
72°C,90s 最后的延伸步驟為 72°C,5 min。

6. 取第二輪 PCR 擴增反應的 5% 進行瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳，估計擴增出的靶 DNA 濃度。
如果引物內設置了限制酶位點，用相應的限制酶消化擴增 DNA, 然后次級克隆進適合的載體。也可以將步驟 5 磷酸化的擴增 DNA 連接至限制酶消化后產生純端的質粒載體中。這種方法的誘變率大約為 80%, 通常僅需要挑選 6 個克隆進行 DNA 序列分析確認存在所希望的突變體，并肯定在 DNA 全序列中不存在其他的突變。