利用改進的CRISPR／Cas9系統高效和特異性地實現單堿基突變

　　在一項新的研究中，利用一種引入DNA單個核苷酸變化的脫氨酶，來自日本神戶大學的研究人員構建出一種改進的CRISPR/Cas9工具，從而避免產生有害的雙鏈斷裂，使得利用CRISPR/Cas9技術引入的附帶突變最小化，而且也不需要加入DNA模板。相關研究結果于2016年8月4日在線發表在Science期刊上，論文標題為“Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems”。

　　美國哈佛大學科學家George Church（未參與這項研究）寫道，“這些脫氨酶解決之前的大多數基因組編輯方法---包括轉錄激活子樣效應因子核酸酶（TALEN）、鋅指核酸酶（ZFN）和Cas9---的最大問題：所需的編輯位點與通過非同源末端連接（non-homologous end-joining, NHEJ）發生的隨機插入和刪除相競爭。[這個系統也]降低由雙鏈斷裂導致的毒性。”他的實驗室也在開發基于脫氨酶的堿基編輯工具。

　　哈佛大學化學生物學教授David Liu（未參與這項研究）說，“當另一家實驗室再現一項重大發現時，它總是令人鼓舞的，而且對這個領域也是有幫助的。這篇論文的作者們也能夠證實這種基因編輯策略在細胞中發揮作用。”

　　利用CRISPR/Cas9系統，人們通過將Cas9導入到細胞中對一種DNA序列進行編輯而產生雙鏈斷裂，同時也將一種DNA模板導入到這種細胞中，這樣該細胞利用這種DNA模板修復這種斷裂。這種編輯過程依賴細胞的同源重組機制，然而其他的修復機制如NHEJ也來競爭執行這種修復任務，因而經常導致不想要的和不準確的序列插入和刪除。

　　論文通信作者、神戶大學科學家Akihiko Kondo告訴《科學家》雜志，“在雙鏈斷裂修復期間，很多事情同時發生，有時發生的核苷酸刪除和插入或者說突變不在我們的控制內。”

　　為了構建一種更加準確的編輯工具，Kondo和他的同事們將一種沒有核酸酶活性的不能夠切割雙鏈DNA的Cas9版本或一種產生單鏈切口的切口酶Cas9版本與一種來自七鰓鰻（sea lamprey）免疫系統的激活誘導性胞苷脫氨酶（activation-induced cytidine deaminase, AID）融合在一起。在正常情形下，這種AID酶在免疫球蛋白和抗體基因中產生突變從而讓免疫系統具有多樣性。AID作用在單鏈DNA上，將胞嘧啶（C）替換為尿嘧啶（U），隨后在一輪DNA復制中，這種尿嘧啶（U）被轉化為胸腺嘧啶（T）。

　　通過測試這種新的雜合復合物是否能夠在出芽酵母---缺乏一種內源性的類似AID的系統---中修飾一種選擇性的標志物，Kondo團隊發現當在向導RNA（gRNA）的引導下，這種蛋白復合物靶向作用于CAN1基因，而且相對于非靶向的選擇性標志物，CAN1基因發生突變的頻率增加了1000倍。利用全基因組測序，研究人員發現很少的脫靶突變，只比背景突變率略有增加。論文第一作者、Kondo實驗室博士后研究員Keiji Nishida說，“[在AID存在下]，這種脫靶突變率是可以接受的，相比于自然的背景突變率增加了不到10倍。”

　　研究人員也證實將兩種不同的gRNA與Cas9-AID復合物一起表達能夠同時對兩種基因進行修飾。

　　相比于沒有核酸酶活性的Cas9-AID復合物，切口酶Cas9-AID復合物能夠在核苷酸替換位點的相反鏈上產生切口，基因編輯效率略高一些。Nishida解釋道，這是因為核苷酸切除修復（nucleotide excision repair, NER）能夠修復AID產生的核苷酸替換，“如果在互補鏈上產生一個切口，那么就不再有參照鏈來校正替換突變”，從而使得想要的核苷酸替換過程更有效率地進行。

　　為了進一步修飾，研究人員將尿嘧啶DNA糖基化酶（uracil DNA glycosylase）抑制劑---與這種Cas9-AID復合物連接在一起，從而增加這種復合物產生C-T替換的效率，同時使得在哺乳動物細胞系中發生的不想要的缺失突變最小化。

　　這種基因編輯復合物也能夠在哺乳動物細胞系中表現良好，導致相對少的脫靶突變。在酵母細胞中，相對于表達標準的CRISPR/Cas9系統，表達上述兩種改進的DNA編輯復合物中的任何一種都能夠導致它們更好的生長，這提示著這種新的編輯工具也是毒性更小的。

　　這種所謂的Cas9-AID復合物具有較高的特異性，對在靶基因中三到五個堿基對窗口中的胞嘧啶（C）進行修飾。Nishida注意到，“令我們吃驚的是，這種突變窗口（mutation window）是如此狹窄。”作出比較，Liu和他的同事們在最近發布的一項研究中，報道了他們的堿基編輯工具變體---使用來自大鼠的一種脫氨酶---的突變窗口在三到六個堿基之間。Liu說，“若要發揮最大的用處，這種堿基編輯窗口不能太寬也不能太窄，因此，這兩種方法有助給人們提供更多的選擇，增加他們能夠解決他們的堿基編輯需求的機會。”

　　對Church而言，開發用于臨床的這種基因編輯工具的關鍵問題之一就是進一步研究脫靶效應。Church寫道，另一個關鍵問題是靶向單個堿基胞嘧啶（C），同時不會靶向攻擊靶序列附近的胞嘧啶（C）。

　　根據Kondo的說法，他的團隊想要進一步拓展這項研究：將Cas9與其他酶連接在一起以便構建出種類齊全的DNA編輯工具箱，從而可能產生4種核苷酸替換突變組合中的任何一種。