引言
“掛羊頭，賣狗肉”是日常用的一個熟語。雖然隨著時間的發展，這句話已經難以反應最真實的情況，在世界上大部分地方，狗已經不作為食用肉的來源，即使在極少數食狗肉的地方，狗肉的價格也往往比羊肉還高，已經失去了造假的意義。但是，這種商品標識與實際商品的組成不一致的情況，卻是長期存在的。自從 2013 年歐盟“馬肉風波”之后，中國肉類摻假的現象也屢見報道，進一步加深了人們對肉類真實性的擔憂。這種非標明的添加，極大的擾亂的市場次序，影響相關宗教人士、特殊風俗與部分肉類禁食人士的情感與健康，也帶來了潛在致病性和疾病控制的難題。目前最常用檢測的方法有：基于核酸的聚合酶鏈式反應技術（PCR），和基于抗體抗原結合的酶聯免疫法（ELISA）。前者受到 DNA 降解，復雜基質的干擾和樣品提取與擴增方法的影響，干擾了定性和定量的準確性。后者往往受制于抗體的制備，加工過程中蛋白變性，復雜基質和近親緣種屬之間同源干擾導致的假陽性的影響 [1, 2]。
隨著生物質譜技術的成熟，大規模的定性和定量研究蛋白表達譜的技術已經很成熟。因此，利用質譜技術尋找不同肉類樣品特征性蛋白或者多肽，并進行定量，能夠避免現在最常用的 PCR 技術和 ELISA 所面臨的上面的種種問題，其優點包括：不受食品加工的過程影響，因為氨基酸序列比核酸序列在加工過程中更容易保存；同時實現定性與定量，避免假陽性且定量結果更加準確可靠；能夠同時監測多種添假 [2]。
豬肉，禽肉，牛肉和羊肉是世界上消耗量最大的四種肉類 [3]。大多數情況下，羊肉最貴，可能比最便宜的禽肉貴到 5 倍以上，在實際生活中，對不法商人具有最大的摻假誘惑力。我們基于超高分辨的 Q Exactive 質譜平臺，研究了五種常見肉類彼此之間的特征性專屬多肽。選取其中找到的部分多肽，通過人為的將幾種不同的肉類進行混合研究，模擬現實中摻假的情況，用 TSQ Qμantiva 建立了基于 SRM（Selected Reaction Monitoring）的摻假比例定量方法。整個實驗流程如下（圖 1）：
圖 1. 基于 Thermo 質譜平臺肉類真實性解決方案。（A：樣品裂解； B：肉類裂解樣品還原烷化酶切；C：高分辨質譜平臺采集每個物種數據；D：Proteome Discoverer 2.0，SEIVE 2.0 軟件尋找物種特征性多肽，Pinpoint 軟件批量自動生成定量離子對；E：TSQ Quantiva 定量分析）
實驗方法：
1.材料與樣品制備
本實驗所用肉類樣品牛肉，豬肉，雞肉和鴨肉購自于上海某大型超市，羊肉購自于上海某羊肉專賣店。五種肉類樣品分別去皮與脂肪取純肌肉樣品約 100 mg，用 RIPA 裂解液裂解后丙酮沉淀，尿素溶解后取部分測濃度，剩余樣品還原烷化，酶切過夜，固相萃取除鹽，離心濃縮后用 0.1%FA 溶解后備用。
2.摻假實驗
將雞與鴨的裂解液等比例混合，取羊 1 μg 總蛋白酶切產物六份，分別添加雞和鴨的裂解酶切產物 1 μg、100 ng、10 ng、5 ng、1 ng、0.1 ng，模擬不同比例的摻假樣品，每份樣品進樣三次。
3.色譜條件
液相 RSLC U3000 ，流速 0.2 mL/min，流動相 A 相為 0.1% FA/H2O，流動相 B 相為 0.1% FA/ACN。色譜柱 Accucore-150-C18，100mm*2.1mm。梯度條件為：
表 1. 色譜梯度
Time (min) | A相（%） | B相（%） |
0 | 100 | 0 |
0.2 | 90 | 10 |
16 | 60 | 40 |
17 | 20 | 80 |
17.5 | 20 | 80 |
18.5 | 100 | 0 |
20 | 100 | 0 |
4.質譜采集方法
質譜離子源參數設置為：噴霧電壓 3500 V，鞘氣 38 Arb，輔氣 15 Arb，反吹氣為 0 Arb，離子傳輸管溫度 275℃，離子源霧化溫度為 380℃。質譜采集參數為：采集周期為 0.3 s， 碰撞氣為 1.5mTorr， Q1 和 Q3 分辨率都為 0.7，源內裂解能量為 0。