利用CRISPR／Cas9技術構建基因敲除大鼠及小鼠模型

　　國際著名生物學期刊《Nature Biotechnology》(2012年影響因子為32.44)于8月8日在線正式發表了上海市調控生物學重點實驗室、華東師范大學生科院生命醫學研究所劉明耀教授和李大力副教授課題組的最新研究成果。這是繼今年6月該課題組在《Nucleic Acids Research》雜志發表基因敲除小鼠新技術后，再次在國際著名生物期刊上報道課題組在基因敲除大鼠和小鼠技術上所獲得突破和成果。

　　基因敲除動物模型一直以來是在活體動物上開展基因功能研究、尋找合適藥物作用靶標的重要工具。但傳統的基因敲除方法需要通過打靶載體構建、ES細胞篩選、嵌合體小鼠選育等一系列步驟，不僅流程繁瑣、技術要求很高，而且費用大、耗時較長，成功率受到多方面因素的限制。劉明耀、李大力課題組一直致力于開發基因敲除動物新技術。其團隊于今年6月在《Nucleic Acids Research》發表了關于轉錄激活樣效應因子核酸酶(TALEN)的技術論文，成為世界上最早利用該技術構建基因敲除小鼠的兩個團隊之一。

　　CRISPR-Cas源自細菌和古細菌的免疫系統，可利用靶點特異性的RNA將Cas9核酸酶帶到基因組上的具體靶點，從而對特定基因位點進行切割導致突變。該課題組將該技術運用到基因敲除小鼠和大鼠動物模型的構建之中。研究發現：RNA注射的方式將CRISPR-Cas系統導入小鼠受精卵比DNA 注射能更有效的在胚胎中產生定點突變;該方法無小鼠遺傳品系的限制，能夠對大片段的基因組DNA進行刪除;同時注射針對不同基因的RNA序列能夠在同一只小鼠或大鼠中產生多個基因突變。此外，課題組利用CRISPR-Cas技術構建的基因敲除大鼠模型與傳統方法構建的同一基因(肥胖相關G蛋白偶聯受體 Mc4R)突變大鼠具有一致的表型。

　　CRISPR-Cas技術是繼鋅指核酸酶(ZFN)、ES 細胞打靶和 TALEN 等技術后可用于定點構建基因敲除大、小鼠動物的第四種方法，且有效率高、速度快、生殖系轉移能力強及簡單經濟的特點，在動物模型構建的應用前景將非常廣闊。目前該團隊已經利用該項技術為上海市計劃生育研究所、上海市東方醫院、上海交大和復旦大學等科研單位和醫藥公司提供了多項動物模型構建服務。

　　該論文的第一作者為李大力副教授和邱中偉博士研究生，同時參與本項研究的單位還有廣西醫科大學。本研究工作得到了國家科技部、教育部、國家自然科學基金委以及上海市科委的經費支持。