利用EarlyTox細胞活力檢測試劑盒評估GM-CSF和TNFα誘導的細胞凋亡
前言：
腫瘤壞死因子(TNFα)是一個關鍵的細胞炎癥因子，它可以通過許多細胞通路來調控各種細胞事件。此因子是在造血細胞中引起凋亡而被人們熟知的，如U937，通過激活細胞內半胱天冬酶的級聯過程。另一方面，粒巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)是 造血生長因子成員之一，可促進增殖和/或分化。然而，有報道稱U937細胞會應答 GM-CSF而發生生長抑制和凋亡。因為TNFα和GM-CSF都會在U937細胞中引起 凋亡，但這兩種細胞活素之間有著不同的時間進程。當兩者結合起來，兩種細胞活素的高度協同作用便會被觀察到。
EarlyTox?細胞活力試劑盒是評價細胞生 長條件的一類試劑之一，包括細胞活性和各種凋亡事件。這些試劑設計為均相免洗實驗并針對熒光微孔讀板機做了優化。這里,我們使用三種不同的試劑盒, Live/Dead測定、Caspase-3/7 R110測定和Caspase-3/7 NucView 488測定來檢測TNFα 和GM-CSF處理U937細胞的效果(圖 1)
? EarlyTox? Live/Dead檢測試劑盒包含兩種針對哺乳動物活細胞或死細胞的標記物。Calcein AM是一種廣泛用于活細 胞的標記物，而溴化乙錠二聚體-III (EthD-III)通過受損的細胞膜進入死細胞與DNA結合以產生明亮的紅色熒光。
? EarlyTox? Caspase-3/7 R110檢測試劑盒提供一步、均相測定，只需細胞裂解 來對凋亡過程進行終點法分析。
? EarlyTox? Caspase-3/7 NucView 488 檢測試劑盒能夠通過利用NucView 488 Caspase-3底物在未受損細胞群中檢測 凋亡細胞。這種試劑對細胞無毒并且可 用于凋亡的動態學研究。
在這一基于細胞的實驗中，熒光信號通過 SpectraMax? i3x微孔讀板機上底讀孔域掃 描功能進行檢測，可獲得孔底12個位置的 平均信號以避免因為潛在的細胞生長不均 所造成的孔與孔之間的差異。
材料：
? U937細胞(ATCC Cat.# CRL-1593.2)
? 細胞因子：
? 人類TNFα (Peprotech Cat# 300-01)
? 人類GM-CSF (Peprotech Cat# 300-03)
? EarlyTox細胞活力試劑盒(Molecular Devices, LLC)：
? EarlyTox Live/Dead檢測試劑盒(Cat.# R8340)
? EarlyTox Caspase-3/7 R110檢測試劑盒(Cat.# R8346)
? EarlyTox Caspase-3/7 NucView 488檢測試劑盒(Cat.# R8348)
? PBS?96-孔，平底，底透，黑色TC-處理的微孔板(Corning cat. #3904)
? SpectraMax i3x多功能微孔讀板機和 SpectraMax? MiniMax 300成像細胞計數儀
方法：
細胞培養和處理
U937細胞培養在RPMI1640培養基中，添加10%FBS和青霉素/鏈霉素。
實驗當天，細胞以100,000細胞/80 μL/孔接種。每孔加入20 μL的5X濃度細胞因子，其終濃度為1X且體積為100 μL。在37C、5%CO2下孵育處理24或48小時
細胞活力和凋亡測定
處理之后，準備好的試劑按照以下描述添 加于每孔中。
活/死測定：2X的calcein AM/EthD-III 工作液由calcein AM和EthD-III儲存液加入到PBS中配成濃度6 μM制成。100 μL的2X工作液添加于每個檢測孔中，終體積為 200 μL且每種染料的終濃度為3 μM。孔板 在室溫下孵育1小時,避光。使用如表1中的設置在SpectraMax i3x讀板機上檢測熒光。